顶空及SERS结合快速检测葱属植物—大葱挥发物*

司民真，李　伦，张川云，张德清

（1.楚雄师范学院云南省高校分子光谱重点实验室，云南楚雄675000；2.楚雄师范学院光谱应用技术研究所，云南楚雄675000）

顶空及SERS结合快速检测葱属
植物—大葱挥发物*

司民真1，2，李伦1，2，张川云1，2，张德清1，2

（1.楚雄师范学院云南省高校分子光谱重点实验室，云南楚雄675000；
2.楚雄师范学院光谱应用技术研究所，云南楚雄675000）

建立了常温常压下快速检测新鲜葱属植物-大葱主要挥发性气体的方法。采用顶空瓶在常温常压下收集大葱的挥发物，将挥发物用注射器注入纳米银胶中，进行SERS测量。结果表明大葱的挥发物SERS光谱重现性非常好；将大葱挥发性物的SERS谱与1-丙硫醇（1-Propanethiol）和烯丙基甲基硫醚（allyl methyl sulfide）混合气体的SERS谱相比，具有较好的相似性，说明大葱的挥发物主要由1-丙硫醇和烯丙基甲基硫醚气体组成。利用Gaussian 03软件获得1-丙硫醇-银（1-Propanethiol-Ag）的Raman光谱，计算结果与1-丙硫醇的SERS实验结果对应较好，说明1-丙硫醇在纳米银基底上的增强为化学增强。顶空与SERS结合可直接用于对葱属植物挥发性物的研究。

葱属植物；大葱；挥发性气体；顶空；SERS；纳米银溶胶

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.008

葱属（Allium L.）是百合科（Liliaceae）葱族（Allieae）的重要类群，全世界700多种［1］，中国有138多种［2-3］。葱属植物含有丰富的生物活性物质，具有多种生理功能，是世界重要蔬菜、药用和观赏植物资源。国内外学者对葱属植物化学成分及药理作用已进行了大量研究，并分离提取出多种类型化合物；如:Reena lawrence等人对大蒜精油抗氧化性进行研究，表明大蒜精油是有效地清除自由基，是一种强大的抗氧化剂［4］。Camila Rodrigues Adão等人从Allium ampeloprasum var.porrum中分离出一种甾体皂苷，发现其具有较好的抗炎性［5］。另外，挥发油的化学成分和含量差异也可作为葱属植物分类的参考依据，Storsberg等人认为挥发性含硫化合物在葱属中具有种的特异性和较稳定的遗传特性，有着重要的分类学意义［6］。杨天慧等采用静态顶空（SHS）固相微萃取法及气相色谱一质谱（GC-MS）联用仪对5种类型大葱、洋葱远缘杂交后代及其亲本中的挥发性成分进行分析，证明杂交后代及其亲本中的挥发性成分有一定相似性和差别性［7］。

目前对葱属植物挥发性物质的研究大多采用顶空微萃取-气象色谱/质谱联用法或气相色谱/质谱联用法如:Block，E等高效气相色谱与质谱联用测试了葱、蒜、韭等8种葱属植物的挥发油成分［8］。刘源等采用项空固相微萃取气质联用分析检测了香葱的挥发性风味成分，共检测到30种化合物［9］。汪潇等采用顶空固相微萃取和气质联用的方法测定其挥发性成分，分别分离得到了多种风味物质［10］。这些方法虽然准确性较高，但耗时、费用高、对样品有一定的破坏性。

Raman光谱具有指纹特性，能够给出样品的化学组成方面的信息，而且操作简单快捷、制备样品用量少、无损、灵敏度高、廉价等优点，Raman光谱技术已经被广泛应用于各个领域。而SERS技术能够增强拉曼信号，具有极高的灵敏度，对某些分子的灵敏度比常规拉曼光谱高102-1014倍，能检测吸附在金属表面的单分子层和亚单分子层的分子，并提供丰富的分子结构信息。但使用SERS技术直接应用于植物挥发性气体检测中的报道并不多见，韩国首尔大学的Kwan kim等将2，6-二甲基苯异腈吸附纳米金上，通过2，6-二甲基苯异腈的N-C伸缩振动峰的峰位发生的移动来间接的检测植物挥发性有机物标样［11］。

本课题组结合顶空及SERS技术对葱属植物的挥发性气体进行了研究，并取得了初步成果。本次工作用顶空技术收集植物挥发性气体，结合SERS分子识别特性，对葱属植物-大葱挥发性气体进行研究。顶空技术的使用，可以免除烦琐的样品前处理过程，可专一性收集样品中的易挥发性成分，避免有机溶剂带入的杂质对分析造成干扰；胶态纳米银作为SERS基底，具有较好的稳定性，并有对混合物中特定物质分子选择增强特性，胶态纳米银中的银粒子与植物挥发性气体中的一种或几种含硫化合物相吸附结合产生拉曼增强效果，从而达到对大葱挥发性气体特定物质分子的检测效果。所得光谱信息希望能为生物化学、分子生物学、及葱属植物系统分类提供参考。

1　仪器与试剂

实验样品大葱采购于楚雄市菜市场。硝酸银，柠檬酸三钠均为分析纯。1-丙硫醇、烯丙基甲基硫醚购于阿拉丁。DXR激光共焦显微拉曼光谱仪（DXR Raman Microscope，美国Thermo Fisher），激发波长785 nm，测定功率2 mW，曝光时间30 s，样品曝光次数3次。UV-vis分光光度计（T-1901，北京普析通用仪器有限公司），分辨率设为2 nm，狭缝宽度设为0.5 nm，扫描范围200 nm-800 nm。

2　实验方法

纳米银溶胶的配制采用本课题组的微波加热法，用去离子水（电阻率为18.25 MΩ·cm）配制0.001 mol/L硝酸银溶液1 000 mL用用去离子水配制1%的柠檬酸三钠溶液26 mL在室温下充分混合后，用微波炉加热27 min后自然冷却，制得纳米银溶胶［12］。将银胶放入瓶中密封保存。

将新鲜大葱洗净，将葱根、茎、叶分开，分别切成均匀的碎块，各分装于5个顶空瓶中。每瓶装五分之四体积左右，共15瓶。装入静置20 min后，从顶空瓶顶部抽出挥发气体缓慢注入1 mL银胶中充分混合后，置于拉曼光谱仪上进行测试，得到15个SERS光谱图。分别抽取500 μL烯丙基甲基硫醚、1-丙硫醇液体于顶空瓶静置15 min后，各抽出挥发气体注入到1 mL银胶中充分混合后，置于拉曼光谱仪上进行测试，得到烯丙基甲基硫醚、1-丙硫醇气体纯样的SERS光谱图。取500 μL液态烯丙基甲基硫醚装入顶空瓶中，再按一定比例加入的液态1-丙硫醇，顶空瓶静置20 min，抽出挥发气体缓慢注入到1 mL银胶充分混合后，置于拉曼光谱仪上进行测试，得到烯丙基甲基硫醚和1-丙硫醇混合气体SERS谱。用DXR激光共焦显微拉曼光谱仪所带的OMNIC 9.0软件对大葱须根部挥发性气体的5个光谱求平均、茎部挥发性气体的5个光谱求平均、叶部挥发性气体的5个光谱求平均，分别得到大葱的须根、茎、叶挥发性气体平均SERS谱，并对这三个平均SRSE光谱及烯丙基甲基硫醚SERS光谱、1-丙硫醇气体SERS光谱，烯丙基甲基硫醚和1-丙硫醇混合气体SERS谱进行归一化。

图1　不同时间购买的新鲜大葱茎部挥发性气体在不同批次银胶上的SERS谱，（a）2013年6月样品+2011年银胶；（b）2013年7月样品+2013年7月银胶；（c）2013年12月样品+2013年11月银胶Fig.1　The SERS spectra of volatile organic compounds of fresh green Chinese onion stems which purchase in different time on nano-silver colloid which made in deferent time，（a）June 2013 sample+2011 nano-silver colloid，（b）July 2013 sample+July 2013 nano-silver colloid，（c）December 2013 sample+November 2013 nano-silver colloid

3　结果与讨论

3.1样品挥发性气体SERS的重现性与银胶稳定性检测

为了检测纳米银胶测试植物挥发性气体的重现性与稳定性，用不同批次银胶分别测定不同时间购买的新鲜葱的茎部挥发性气体的SERS谱。具体为分别用2011年制备的银胶测试2013年6月买的新鲜大葱挥发性气体SERS、2013年7月制备的银胶测试2013年7月买的新鲜大葱挥发性气体SERS、2013年11月制备的银胶测试2013年12月买的新鲜大葱挥发性气体SERS。发现大葱的发性气体的SERS谱峰非常相似。如图1所示，三次测试的大葱茎的挥发性气体SERS谱峰位和峰形对应较好。结果表明:银胶与新鲜样品挥发性气体结合较稳定，以微波法制备的纳米银溶胶为基底测试大葱挥发性气体SERS谱的重现性非常好。

3.2大葱挥发性气体SERS谱分析

为了考察大葱的挥发物的主要成分，测试了烯丙基甲基硫醚气体和1-丙硫醇气体的SERS谱，图2中a、b谱线分别为烯丙基甲基硫醚气体和1-丙硫醇气体的SERS谱，c、d、e谱线分别为大葱的根、茎、叶挥发性气体的SERS谱的平均光谱。从图2中看出，烯丙基甲基硫醚气体的SERS谱的特征峰为626、674cm-1，这两个特征峰在大葱根、茎挥发性气体的SERS谱（c、d）可找到对应的谱线622、671 cm-1而在叶中变得不明显；1-丙硫醇气体的SERS谱（b）的特征峰为373、702、893、1 024、1 215、1 320cm-1，从图中大葱的挥发性气体SERS谱c、d、e很容易找到对应的谱线373、695、893、1 026、1 216、1 322 cm-1。表明大葱的挥发性物主要由1-丙硫醇和烯丙基甲基硫醚气体组成。大葱挥发性气体中有较高含量的1-丙硫醇已得到证实，如杨天慧等［7］利用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术对大葱挥发性成分进行分析，测得1-丙硫醇的相对含量达69%。

图2c、d、e中大葱挥发物SERS谱中还有780、1 602 cm-1的谱线在图2 a、b中未找到相应的谱线，为找到这两条谱线的来源，我们做了如下的工作:1将1-丙硫醇与烯丙基甲基硫醚按一定比例混合后，测量其挥发气体SERS谱；2将1-丙硫醇和烯丙基甲基硫醚气体SERS谱直接相加。图3 a为1-丙硫醇与烯丙基甲基硫醚按一定比例混合后所得挥发气体SERS谱，3 b为1-丙硫醇和烯丙基甲基硫醚气体SERS谱相加结果图。对比图3a、b，图3 a SERS谱比b中多778cm-1和1 605 cm-1两个峰，对比图3a与图2c，大葱挥发性气体SERS恰恰有对应的780、1 602 cm-1附近两个峰，并且图2 c谱线与图3 a谱线峰位峰形对应非常好，只是626、674、695 cm-1附近三个峰向低波数分别移动到622、674、695 cm-1附近，这进一步说明大葱的挥发性气体SERS光谱主要由1-丙硫醇和烯丙基甲基硫醚气体的SERS谱带组成，也说明1-丙硫醇和烯丙基甲基硫醚同时与纳米银溶胶作为基底产生SERS增强时并不是单纯的叠加结果，可能还存在某些相互作用。

图2　（a）烯丙基甲基硫醚挥发性气体SERS谱；（b）1-丙硫醇挥发性气体SERS谱；（c）葱根部挥发性气体SERS谱；（d）葱茎部挥发性气体SERS谱；（e）葱叶部挥发性气体SERS谱Fig.2　（a）The SERS spectra of volatile organic compounds of allyl methyl sulfide；（b）1-Propanethiol；（c）greenChineseonionroots；（d）stemsand（e）leaves

图3　（a）1-丙硫醇与烯丙基甲基硫醚按一定比例混合的挥发气体SERS谱；（b）1-丙硫醇气体SERS谱和烯丙基甲基硫醚气体SERS谱相加的加谱Fig.3　（a）The SERS spectrum of volatile organic compounds of the mixture of liquid 1-Propanethiol and allyl methyl sulfide；（b）The spectrum consists of SERS spectrum of 1-Propanethiol adding SERS spectrum of allyl methyl sulfide

3.31-丙硫醇与纳米银粒子发生吸附行为的模拟计算

在实验中还发现以下几个现象:

（1）当1-丙硫醇气体注入纳米银溶胶以后，纳米银溶胶由灰色变为黑色。

（2）纳米银溶胶的UV-vis吸收光谱吸收峰在440 nm附近，而将1-丙硫醇气体注入银胶后，得到的UV-vis吸收光谱吸收峰变宽，最高吸收峰移到了400 nm附近，并且在400-800 nm范围形成较宽的吸收带（见图4）。

图4　（a）纳米银溶胶的UV-vis吸收光谱，（b）注入1-丙硫醇气体的纳米银胶聚合物的UV-vis吸收光谱Fig.4　（a）The UV-vis absorption spectrum of the nano-silver colloid；（b）the UV-vis absorption spectrum of silver colloid which was injected into the volatile organic compounds of 1-Propanethiol

以上现象表明1-丙硫醇化学吸附于纳米银上。为了研究1-丙硫醇H原子解离后C3H7S基团中的S与Ag原子发生吸附的行为，理论计算采用Gaussian'03程序，运用HF方法，在LanL2dz基组水平上，对C3H7S-Ag构象的几何结构进行优化，在优化的基础上对振动频率进行了理论计算，所有波数都乘以校正因子为0.93。其结构优化结果如图5所示，计算得到的Raman光谱如图6a所示。图6b是1-丙硫醇气体SERS谱，比较图6a、图6b可以看出，理论计算C3H7S-Ag的Raman谱线和实验测得1-丙硫醇气体SERS谱峰位吻合较好。图6c是1-丙硫醇液体的Raman谱，从图中可见位于2 573、651 cm-1附近有两个强的尖峰（分别归属为S-H和C-SH伸缩振动），在810 cm-1附近有弱峰（归属为S-H变形振动）［13］。而这个三峰在1-丙硫醇气体SERS谱和大葱根、茎、叶挥发性气体SERS谱中都没有发现。这说明1-丙硫醇在银胶中的巯基S-H键断裂，解离后的硫醇基团化学吸附在纳米银颗粒上，这与理论计算的结果一致。而且理论研究表明，丙硫醇在Au表面吸附时H原子解离后C3H7S基团中的S与Au原子会产生较多成键电荷，形成强化学吸附［14］。表1给出计算的C3H7S-Ag振动频率、强度以及指认。1-丙硫醇气体吸附在纳米银上SERS谱的频率及可能的指认一同列于表1中。

图5　C3H7S-Ag的优化结构图Fig.5　Optimized structure of C3H7S-Ag

表1　C3H7S-Ag的理论计算光谱和观测的1-丙硫醇吸附在银胶上的光谱的振动归属Tab.1　Calculated（scaling factor 0.93）of C3H7S-Ag and observed frequencies of 1-Propanethioladsorbed on nano-silver colloid

图6　（a）理论计算的C3H7S-AgRaman谱；（b）1-丙硫醇的SERS谱；（c）液态1-丙硫醇的Raman谱Fig.6　（a）Calculated Raman of C3H7S-Ag；（b）SERS spectrum of1-Propanethiol；（c）Raman spectrum of 1-Propanethiol

4　结论

利用纳米银溶胶作为SERS基底对大葱挥发性气体进行测试，发现银胶与新鲜样品挥发性气体结合较稳定，大葱挥发性气体SERS的重现性非常好；大葱挥发性气体主要由1-丙硫醇和烯丙基甲基硫醚气体组成。理论计算与实验结果表明都表明1-丙硫醇气体与纳米银胶基底发生化学吸附。利用纳米银溶胶作为SERS基底可以对大葱挥发性气体中的1-丙硫醇、烯丙基甲基硫醚成分进行检测，具有操作快捷、制备样品简单且用量少、无损、灵敏度高、廉价等优点。本研究只是用纳米银溶胶对葱属植物-大葱挥发性气体进行了测试。对于其他形式的SERS基底、其他种的葱属植物挥发性气体的研究正在进行中。希望利用顶空与SERS结合可以检测出更多药用植物挥发性气体成分。

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Rapid Detection of Volatile Organic Compounds of Green Chinese Onion Using Headspace Combined with SERS

SI Minzhen1，2，LI Lun1，2，ZHANG Chuanyun1，2，ZHANG Deqing1，2
（1.Key Laboratory of Molecular Spectroscopy，Colleges and Universities in Yunnan Province，Chuxiong Normal University，Chuxiong 675000，Yunnan，China；2.Application Institute of Spectroscopy Technology，Chuxiong Normal University，Chuxiong 675000，Yunan，China）

To develop a rapid method under normal pressure and temperature using Headspace combined with SERS for the detection of the volatile organic compounds of green Chinese onion.Collection volatile organic compounds of green Chinese onion under normal pressure and temperature with Headspace vial，then the gas was drawn from the vial with a syringe and were injected very slowly into nano-silver colloids for test.The SERS spectrum of volatile organic compounds of green chinese onion and the SERS spectrum of the mixture of liquid 1-Propanethiolate and allyl methyl sulfide had been obtained.The results showed that the repeatability of SERS spectrum of volatile organic compounds of green chinese onion was very good.And the SERS spectrum of volatile organic compounds of green Chinese onion mainly consists of 1-Propanethiol and allyl methyl sulfide.The Raman spectra of 1-Propanethiol-Ag had been calculated by Gaussian 03.The calculation corresponded well with SERS of 1-Propanethiol.This suggest that adsorption of 1-Propanethiol on nanosilver colloids is chemisorption.The headspace combined with SERS can be directly used to research volatile organic compounds of Allium.

Allium；green chinese onion；volatile organic compounds；headspace；SERS；nano-silver colloid

R917

A

1007-7146（2015）04-0348-06

2015-05-02；

2015-05-17

国家自然科学基金（11364001，10864001，11064001）资助课题

司民真（1962-），女，汉族，云南昆明人，教授，博士，主要从事分子光谱方面的研究。（电话）0878-3121785；（电子邮箱）siminzhen@cxtc.edu.cn