谷氨酰胺预处理对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用及其对eNOS-NO通路的影响

牛琼，王爱丽，王伟，胡营滨，刘成霞

谷氨酰胺预处理对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用及其对eNOS-NO通路的影响

牛琼，王爱丽，王伟，胡营滨，刘成霞△

目的探讨谷氨酰胺（Gln）预处理对大鼠肠缺血再灌注损伤（IR）后的保护作用及其对内皮型一氧化氮合酶（eNOS）/一氧化氮（NO）信号通路的影响。方法将30只健康雄性Wistar大鼠随机分为假手术（Sham）组、IR组、Gln组，每组10只，Gln组给予谷氨酰胺1 g/（kg·d），连续灌胃7 d。Sham组和IR组以同等剂量生理盐水灌胃7 d。Sham组仅分离肠系膜上动脉（SMA）而根部不夹闭。IR组和Gln组均用无损伤血管夹夹闭SMA根部，30 min后放松血管夹形成再灌注损伤模型。各组大鼠均于制模后24 h采集腹主动脉血和回肠标本。应用HE染色法观察肠黏膜组织形态学改变，ELISA试剂盒双抗体夹心法测定D-乳酸、内毒素含量，硝酸还原酶法检测血清NO的含量，比色法检测血清eNOS、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的含量，荧光定量PCR（RT-PCR）检测大鼠肠组织eNOS、iNOS mRNA表达水平。结果再灌注后，与Sham组相比，IR组肠黏膜绒毛上皮脱落，固有层崩解，部分绒毛顶端出血，腺体明显受损；Gln组表现为肠黏膜绒毛上皮下间隙扩大，但不明显，绒毛轻度水肿，腺体大致正常，固有层轻度水肿。IR组血清D-乳酸、内毒素、iNOS水平及肠组织iNOS mRNA表达水平均高于Sham组和Gln组（P＜0.05）。IR组血清NO、eNOS含量及组织中eNOS的mRNA表达量均低于Sham组和Gln组（P＜0.05）。结论谷氨酰胺预处理可以减轻肠缺血再灌注后的组织形态学改变及损伤，其机制可能与抑制iNOS表达，增加eNOS表达，从而增加NO活性有关。

谷氨酰胺；肠；缺血；再灌注损伤；一氧化氮合酶；肠缺血再灌注损伤；内皮型一氧化氮合酶；诱导型一氧化氮合酶

缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IR）是各种原因导致组织器官缺血时，引起细胞代谢障碍和组织结构出现破坏［1］，当血供恢复时，组织及细胞损伤反而出现加重的现象［2］。肠道黏膜屏障是防止肠道内有害物质和病原体进入机体内环境，并维持机体内环境稳定的一道重要屏障［3］。肠IR损伤过程中，内皮细胞和上皮细胞屏障功能被破坏，进而引起细菌发生移位，可引起全身性的免疫应答和多器官功能障碍（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）［4］。谷氨酰胺是肠上皮细胞重要的营养物质，在氧化应激中对机体起到保护作用［5］。本课题组前期研究表明，谷氨酰胺对体外肠上皮细胞的IR具有保护作用［6］。本研究拟利用大鼠建立肠IR模型，探讨谷氨酰胺对大鼠肠IR后的保护作用及其可能作用机制。

1　材料与方法

1.1药品与试剂谷氨酰胺粉末，纯度99%，购自美国Sigma公司；综合国内外文献，本实验采用的剂量为1 g/kg。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）及内皮细胞型一氧化氮合酶（eNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，D-乳酸试剂盒购自厦门慧嘉生物有限公司，内毒素试剂盒购于厦门鲎试剂实验厂有限公司，HE所需相关试剂如伊红、苏木精和盐酸酒精分化液等由实验室自行配制而成。Trizol试剂、逆转录试剂盒、荧光定量检测试剂盒购于TaKaRa大连宝生物有限公司；引物设计与合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2实验动物与分组30只清洁级健康成年雄性Wistar大鼠，体质量220～250 g，购自山东大学实验动物中心，批号：SOXXK（鲁）20090001。抽签法随机分为假手术（Sham）组、缺血再灌注（IR）组、谷氨酰胺（Gln）组，每组10只。

1.3方法

1.3.1动物处理及模型的建立Gln组于造模前7 d开始给予1 g/（kg·d）谷氨酰胺连续灌胃，Sham、IR组分别于造模前给予同等剂量生理盐水灌胃。所有大鼠术前禁食12 h，自由饮水，10%水合氯醛腹腔注射（3 mL/kg）麻醉。Sham组：取腹正中切口，长约3.0 cm，用温盐水纱布将肠管推向左侧腹腔，暴露右肾内上方的肠系膜根部，找到肠系膜上动脉（SMA），分离SMA后不作阻断。IR组则显露SMA，用无创血管夹阻断其系膜血管30 min，造成肠缺血模型，松夹再灌注24 h。Gln组显露SMA余操作同IR组。操作过程中所有大鼠腹腔注入37℃生理盐水0.5 mL/kg。以保持血流动力学稳定。实验结束后关腹。

1.3.2标本取材与处理IR再灌注24 h后再次麻醉剖腹，立即从腹主动脉采集血标本，行全血离心（4℃、3 000 r/min）。20 min后分装血清，-80℃冰箱保存备用。剪取距回盲部约10 cm处4.0 cm长回肠标本，迅速用冷生理盐水溶液冲洗，清除黏液、污物等肠腔内容物后，用滤纸吸干，立即投入装有4%多聚甲醛溶液中固定，以备组织病理学检测。

1.4实验指标检测

1.4.1光镜HE染色切取小块置于4%多聚甲醛溶液中固定，乙醇逐级脱水，定向包埋，连续切片（厚度5 μm）。常规梯度乙醇脱水，染色，二甲苯透明，中性树胶封片。Matic Images Advanced 3.2图像分析系统采集图片。

1.4.2大鼠血清内毒素的测定应用ELISA试剂盒，将已知内毒素浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将内毒素及其抗体温育。洗涤后加入亲和素标记过的辣根过氧化物酶（HRP）后，加入底物A、B，终止反应后于545 nm波长处读取吸光度（A）值，建立标准曲线，测得样品中内毒素的浓度。

1.4.3血清中D-乳酸含量的测定采用慧嘉生物公司D-乳酸酶联免疫分析试剂盒，应用双抗体夹心法测定血清中大鼠D-乳酸的水平。用酶标仪在450 nm波长下测定A值，通过标准曲线计算样品中大鼠D-乳酸的浓度。

1.4.4血清NO、eNOS、iNOS含量的测定根据说明书方法，采用硝酸还原酶法测定NO含量，比色法测定eNOS、iNOS含量。

1.4.5肠组织eNOS、iNOS mRNA表达的测定用Trizol一步法提取RNA，用微量核酸蛋白测定仪（Gene Company Limited ND2000）测定RNA的浓度和纯度；逆转录按试剂盒说明书操作。eNOS引物上游5′-GGTGGACAACATCGCTCTG-3′，下游5′-AGACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3′；iNOS引物上游5′-TTGCTACAGGGTTTCATCCAG-3′，下游5′-ATGTTGTTGTCCAGTTCATCG-3′。β-actin引物上游 5′-GAAGTGTGACGTTGACATCCG-3′，下游5′-TGCTGATCCACATCTGCTGGA-3′。按SYBR Premix Ex TaqTM的RT-PCR试剂盒说明书操作，扩增条件为：预变性95℃30 s，变性95℃5 s，退火60℃34 s，最后延伸10 min，40个循环，重复实验3次。在荧光定量PCR分析仪上（Roter Gene 3000-澳大利亚Corbett公司）进行扩增。用2-ΔΔCt方法分析各组mRNA的差异。

1.5统计学方法采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1谷氨酰胺对IR后肠黏膜形态学的影响Sham组绒毛排列整齐，无水肿。腺体正常，上皮下间隙无扩大，固有层无水肿、无出血；IR组主要表现为肠黏膜绒毛上皮脱落，固有层崩解，部分绒毛顶端出血，腺体明显受损；Gln组表现为肠黏膜绒毛上皮下间隙扩大，但不明显，绒毛轻度水肿，腺体大致正常，固有层轻度水肿，见图1。

2.2谷氨酰胺对肠IR后血清中内毒素、D-乳酸水平的影响与Sham组相比，IR组和Gln组血清中内毒素、D-乳酸含量升高；与IR组相比，Gln组内毒素、D-乳酸含量降低（P＜0.05），见表1。

Fig.1　Comparison of HE staining of intestinal tissues between three groups（×400）图1　各组大鼠肠组织HE染色结果比较（×400）

Tab.1　Comparison of serum endotoxin and D-lactic acid levels between three groups表1　各组大鼠血清中内毒素及D-乳酸含量的比较（n=10，±s）

Tab.1　Comparison of serum endotoxin and D-lactic acid levels between three groups表1　各组大鼠血清中内毒素及D-乳酸含量的比较（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a与Sham组比较，b与IR组比较，P＜0.05；表2、3同

组别Sham组IR组Gln组F内毒素（EU/mL）0.162±0.069 0.557±0.208a0.330±0.013ab57.872＊＊D-乳酸（mg/L）0.997±0.079 3.988±0.087a1.685±0.105ab35.601＊＊

2.3谷氨酰胺对IR后NO及NOS的影响与Sham组相比，IR组血清NO、eNOS含量下降，iNOS含量升高；Gln组NO、eNOS、iNOS含量差异无统计学意义（P＞0.05）。与IR组相比，Gln组血清NO、eNOS含量升高，iNOS含量下降，见表2。与Sham组相比，IR组肠组织 eNOS mRNA表达下降，iNOS mRNA表达升高；Gln组肠组织eNOS、iNOS mRNA表达升高。与 IR组相比，Gln组 eNOS mRNA表达升高，而iNOS mRNA表达下降，见表3。

Tab.2　Comparison of serum NO,eNOS and iNOS contents between three groups表2各组大鼠血清NO、eNOS、iNOS含量的比较（n=10，±s）

Tab.2　Comparison of serum NO,eNOS and iNOS contents between three groups表2各组大鼠血清NO、eNOS、iNOS含量的比较（n=10，±s）

组别Sham组IR组Gln组F NO（μmol/L）43.220±2.306 30.640±2.863a42.173±3.217b60.153＊＊eNOS（U/mL）19.456±1.780 14.230±1.389a22.634±2.132b79.681＊＊iNOS（U/mL）10.930±0.983 17.154±1.143a11.622±0.821b37.170＊＊

Tab.3　Comparison of eNOS and iNOS mRNA expressions in intestinal tissues between three groups表3各组大鼠肠组织eNOS、iNOS mRNA表达水平比较（n=10，±s）

Tab.3　Comparison of eNOS and iNOS mRNA expressions in intestinal tissues between three groups表3各组大鼠肠组织eNOS、iNOS mRNA表达水平比较（n=10，±s）

组别Sham组IR组Gln组F eNOS 1.000±0.000 0.672±0.083a1.482±0.120ab27.385＊＊iNOS 1.000±0.000 2.165±0.172a1.542±0.170ab19.580＊＊

3　讨论

3.1关于肠IR及其病理生理机制IR是创伤、严重感染及休克等疾病共同存在的病理生理过程。小肠是对IR最敏感的器官之一，在肠绞窄、小肠移植和肠系膜血管缺血性疾病等情况下，均会引起小肠的缺血性损伤，同时，小肠是机体最大的细菌库，缺血再灌注损伤消化道，削弱小肠的生理屏障功能，肠道黏膜屏障功能损伤的主要病理改变是肠黏膜通透性增加，从而导致内毒素血症、肠内细菌移位，引起大量炎症因子的释放，诱导全身炎症反应综合征和MODS的发生［1，3］。内毒素是革兰阴性菌细胞壁的脂多糖成分，是炎症反应的主要触发因素［7］。正常情况下，机体肠腔内含大量细菌和内毒素。由于肠道屏障功能完整，细菌和内毒素难以进入血液循环，当肠道屏障功能障碍时，内毒素可穿过肠黏膜，进入血液循环，形成内毒素血症。D-乳酸是细菌发酵的代谢产物，由肠道多种细菌产生，当肠道发生急性缺血等损伤致肠黏膜绒毛顶端上皮脱落，细胞旁路径增加而致肠黏膜通透性增加时，肠道中细菌产生的大量D-乳酸通过受损黏膜入血，人体内缺乏D-乳酸脱氢酶，并且其他替代途径代谢缓慢，因此监测血中乳酸水平可反映肠黏膜损害程度和通透性变化［8］。

3.2关于eNOS/NO机制NO及影响NO合成的主要调节因子NOS在肠IR中的作用已被既往研究证实。NO在生理情况下由eNOS催化合成，正常情况下eNOS即有表达，然而，在病理情况下，如糖尿病和IR时，eNOS催化产生的NO通常被认为是具有保护作用的。而炎症反应会促使iNOS表达增加，进而引起其合成的NO增加，对机体产生不利影响［9-10］。在IR或缺氧复氧情况下，大量NO与超氧化物自由基反应形成过氧亚硝酸盐，过氧亚硝酸盐的亚硝化反应可能会增加NO的有害影响［11］。IR后内皮功能失调和炎症过程的激活同时存在［12］，内皮功能失调表现为eNOS活性降低，其产生的有益的NO减少，而炎症过程激活后，进而引起iNOS激活，使其产生的有害的NO增加，导致净结果为NO含量增加［13］，从而对肠道产生毒性作用。因此，本研究拟探讨谷氨酰胺预处理是否可通过调节iNOS和eNOS的表达来发挥肠缺血再灌注损伤后肠黏膜的保护作用。

本研究参照文献［14］的方法制备大鼠肠IR模型，HE染色结果提示肠IR模型制备成功。笔者通过测定肠IR大鼠肠道细菌代谢产物D-乳酸及血浆内毒素水平来了解其肠道屏障功能及肠通透性的变化。结果显示在肠缺血再灌注状态下，肠黏膜屏障功能障碍、肠通透性升高，并出现内毒素血症。而Gln组血浆D-乳酸、内毒素水平较IR组显著降低，保护肠黏膜免受损伤，降低内毒素血症的发生。由此可见，谷氨酰胺处理可以减低IR。大鼠血清NO、eNOS、iNOS及肠组织eNOS、iNOS mRNA的表达水平结果表明，谷氨酰胺预处理可能是通过抑制iNOS表达，促进eNOS表达，进而增加NO表达释放来发挥肠黏膜保护作用的，但Gln调节NO的确切信号通路还有待于进一步研究。

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（2014-10-08收稿2014-12-30修回）

（本文编辑李鹏）

The protective effect of glutamine pretreatment on intestinal ischemia-reperfusion injury and eNOS/NO levels in rats

NIU Qiong，WANG Aili，WANG Wei，HU Yingbin，LIU Chengxia△
Department of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Binzhou Meidcal University，Binzhou 256603，China
△Corresponding AuthorE-mail：phdlcx@163.com

ObjectiveTo investigate the protective effect of glutamine（Gln）pretreatment on intestinal ischemia-reperfusion （I/R）injury and endothelial nitric oxide synthase（eNOS）/nitric oxide（NO）signaling pathway in rat model.MethodsThirty male Wistar rats were randomly divided into three groups（n=10 for each group）:sham group，I/R group and Gln group.Animals were pretreated with 1 g/（kg·d）Gln by orogastric route for 7 days in Gln group，and normal saline was given to the other two groups in the same dose.Intestinal I/R was induced by 30 min occlusion of the superior mesenteric artery followed by 24 h of reperfusion. After the operation，the intestinal histopathological changes，the plasma endotoxin level，serum D-lactic acid，eNOS，inducible NOS（iNOS）activity and NO levels were detected by ultraviolet spectrophotometer.The mRNA expressions of myocardial eNOS and iNOS were detected by real-time fluorescence quantitative PCR（RT-PCR）.ResultsAfter reperfusion，in IR group，extensive epithelial sloughing and mucosal ulceration of villous tips were observed，whereas these findings did not occur in Gln group and sham group.Compared with IR group，the serum NO，eNOS levels and eNOS mRNA expression of intestinal tissue were elevated in Gln group（P＜0.01），but the plasma endotoxin level，serum D-lactic acid，serum iNOS and intestinal iNOS mRNA expression decreased in IR group（P＜0.05）.ConclusionGlutamine pretreatment has protective effects on intestinal ischemia-reperfusion injury in vivo.The mechanism may be related to the inhibition of iNOS expression and the increased expression of eNOS，thereby increasing NO activity.

glutamine；intestines；ischemia；reperfusion injury；nitric oxide synthase；intestinal ischemia-reperfusion injury；eNOS；iNOS

R364

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.008

山东省自然科学基金（ZR2010HL051）

山东省滨州市滨州医学院附属医院消化内科（邮编256603）

牛琼（1973），女，硕士，副教授，副主任医师，主要从事肠黏膜屏障的临床与基础研究

△E-mail：phdlcx@163.com