高效液相色谱法测定水中痕量苯并芘的研究

李　敏，蔡伊莎，韩宝武，夏　亮

(南充市环境监测中心站，四川 南充　637000)

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高效液相色谱法测定水中痕量苯并芘的研究

李敏，蔡伊莎，韩宝武，夏亮

(南充市环境监测中心站，四川 南充637000)

建立了一种高效液相色谱法测定水中苯并[a]芘的分析方法。找到最佳色谱分析条件，荧光检测器激发波长290nm，发射波长406nm，流动相为 (乙腈)∶(水)=80∶20。应用此检测条件得出苯并[a]芘在0～100μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数r=0.9999，方法检出限低至0.012ng/L，样品加标回收率为86.9%～103.0%，精密度为2.7%～4.9%。结果表明，该方法灵敏度高，分析时间短，定量准确，适用于环境水样和生活饮用水中痕量苯并芘的测定。

高效液相色谱法；苯并芘；色谱条件；检出限

多环芳烃(PAHs)是一类广泛分布并稳定存在于自然环境中的含2个以上苯环的有毒有机污染物，具有较强诱癌作用，目前已经鉴定出数百种，其中以苯并[a]芘[benzo(a)pyrene，B(a)P]最为重要[1]。苯并[a]芘是多环芳烃中致癌性最强的一种化合物，可诱发皮肤、肺和消化道癌症，是环境污染主要监测项目之一。由于对人体的严重危害，我国地表水环境质量标准规定集中式饮用水地表水水源地特定项目苯并[a]芘的标准限值为2.8ng/L[2]，饮用水卫生标准规定饮用水中苯并[a]芘单体应低于0.01μg/L[3]。

苯并芘的测定方法主要有薄层层析法、荧光光度法、紫外光度法和高效液相色谱法。薄层层析法、荧光光度法和紫外光度法样品处理繁琐，灵敏度较低[4～6]，目前国内外主要选用高效液相色谱-荧光法法测定环境中苯并[a]芘等具有荧光特性的多环芳烃类物质[7～10],此方法具有很高的选择性和灵敏度, 且操作简单。

本文在高效液相色谱法分析测定多环芳烃方法的基础上进一步优化色谱条件，找到最优检测波长，建立了一种样品前处理简单，线性范围宽，精密度、准确度高，分析灵敏度高的水样中痕量苯并芘检测方法。

1　实验部分

1.1主要仪器及试剂

岛津LC-20A液相色谱仪配荧光检测器, 液液萃取装置, TurboVapⅡ全自动氮吹仪；正己烷、乙腈, 均为色谱纯。苯并芘标准储备液( 二氯甲烷中的苯并芘溶液，0.2μg /mL，美国AccuStandard公司生产)。

1.2色谱条件

色谱柱: Eclipse XDB-C18, 150mm×4.6mm , 5μm。

流动相: 乙腈/水= 80：20;柱温40℃; 进样量20μL;流速：1.0mL/min。

荧光检测器检测波长: 激发波长(λex)：290nm，发射波长(λem)：406nm。

1.3样品采集及保存

参考国家环境保护标准HJ 478-2009“5 样品”中样品的采集及保存方法。

1.4样品前处理

用量筒取500mL水样于1L分液漏斗中，加入少许氯化钠摇匀。用90mL正己烷分3次萃取，每次30mL，于振荡器上充分振摇5min。注意手动振摇放气。静置分层后，将有机相通过装有无水硫酸钠的漏斗，接至150mL氮吹瓶中，注意无水硫酸钠要充分淋洗。合并3次正己烷萃取液。用自动氮吹仪浓缩至0.5mL，用乙腈定容至1.0mL，供HPLC分析。饮用水和地下水可以浓缩后直接测定，地表水和废水等基体复杂的水样则需要进一步净化，净化方法如下。

将水样的萃取液经旋转蒸发器浓缩至1mL, 将浓缩液及样品容器洗涤液全部转移到预先用正己烷溶液10mL 活化后的硅胶小柱上, 用二氯甲烷/正己烷(1+1)溶液20mL淋洗, 淋洗液浓缩至0.5～1mL, 加乙腈3mL, 氮吹浓缩至0.5mL, 最后用乙腈准确定容到1.0mL, 供HPLC分析。

1.5样品分析

1.5.1标准系列溶液的配制和测定

将苯并芘标准溶液用乙腈逐级稀释成浓度为0.00，0.01、0.05、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 μg/L，在“1.2”色谱分析条件下进行测定，每个平行测定3 次，取平均值。

1.5.2色谱条件的确定

分别针对不同的流动相比例及不同的检测波长进行分析，对比实验结果，确定最佳的色谱条件。

2　结果与分析

2.1色谱流动相的选择

本实验分别采用乙腈∶水为90∶10、80∶20、70∶30 等不同比例进行分析，当乙腈∶水为80∶20 时，苯并芘的峰与样品基质分离效果好，且出峰较快,苯并[a]芘的出峰时间为7.211min; 乙腈体积大于此比例时，苯并芘的峰与杂质峰分离不完全; 乙腈体积小于此比例时，苯并芘出峰时间较长。

2.2检测波长的优化

分别测定生活饮用水标准检验方法(GB/T 5750.8-2006)标准方法中激发波长为303nm，发射波长为425nm；环境保护标准方法HJ 478-2009中的激发波长为290nm，发射波长为430nm；文献报道中激发波长为285nm，发射波长为406nm[8]；以及自建方法优化波长激发波长为290nm，发射波长为406nm，分别将1.00μg/L 浓度的标准样品经HPLC分析检测,测定结果见表1。不同波长条件下苯并芘的色谱图见图1。由图1可见，积分峰面积最大的波长条件是自选优化的激发波长为290nm，发射波长为406nm，因此将其定为最佳检测波长。

表1　不同波长条件下样品的测定结果

图1　不同波长条件下苯并芘的色谱图Fig.1　B(a)P chromatograms under different wavelength conditions

2.3标准曲线

“1.5.1”项中标准系列按照上述条件进行测定，以苯并芘的峰面积(Y) 对浓度( X, μg/L) 绘制标准曲线。所得直线回归方程为Y=104424X -27686(相关系数r = 0.9999)，线性范围为0～100μg/L，标准曲线最低点浓度0.01μg/L的标准谱图见图2。

图2　0.01μg/L标准样品色谱图Fig.2　Chromatogram of 0.01μg/L standard solution

图3　1.00μg/L 实际样品色谱图Fig.3　Chromatogram of 1.00μg/L spiked sample

2.4方法检出限

根据美国EPA, 方法检出限为MDL = S × t( n, 1-a)，将7个相同浓度为5.0×10-5μg/L的标准水溶液按“1.4”方法处理后，在最佳色谱条件下经HPLC分析,测量结果见表2，置信水平为99%，查t值为3.143。计算出苯并芘检出限为0.012ng/L。

表2　检出限

2.5方法精密度和加标回收率实验

苯并芘[B(a)P]是自然界中广泛存在的一类污染物，考虑到其毒性及二次污染问题，本文以较低浓度的加标量进行回收率及精密度实验。取3个已知浓度的样品，分别在此3种水样中加入低(0.004μg/L)、中( 0.20 μg/L) 、高( 1.00 μg/L) 3 个浓度的B(a)P标准溶液，使加标前后的浓度在线性范围内，按样品处理步骤进行测定，对每个加标浓度的样品平行测定6次，连续测定6天，分别计算日内和日间精密度。所得结果见表3。加标量从0.004μg/L～1.0μg/L时回收率在89.9%～94.8%之间，经液液萃取后实际样品色谱图见图3；平行6次进行精密度试验，相对标准偏差(RSD)在2.7%～4.9%，满足相关要求。表明方法比较稳定，重现性较好，分析准确度高。

将加标浓度分别为0.004μg/L和1.00μg/L的水样经萃取后做进一步净化，加标回收率和精密度见表4。测定结果显示，低浓度和高浓度水样净化后回收率范围分别在73.5%～87.0%和84.6%～97.5%之间，相对标准偏差(RSD)分别为5.8%和4.2%。由表3、表4可以看出，低浓度加标样品净化后的回收率有所降低，高浓度基本无影响，结果表明本方法有较好的精密度和准确度。

表3　样品中苯并芘的加标回收率和精密度

表4　水样提取液经净化后方法回收率和精密度

3　结　论

本方法所用最佳色谱条件目前未见报道，线性范围较宽，方法检出限低至0.012ng/L，远低于《水质-多环芳烃的测定》(HJ 478-2009)中的检出限0.004μg/L和《生活饮用水标准检验方法》(GB5750.8-2006)中的检出限1.4ng/L，能完全满足水质环境标准和水质卫生标准的分析要求。实际样品加标回收率较高，方法精密度、准确度高。本方法有毒有害试剂用量小，灵敏度高，操作简单，分析时间短，提高了检测效率，完全适用于环境水样和生活饮用水中痕量苯并芘的测定。

[1]Vazquez T S, García F M S, González A S, et al. Enrichment of benzo[a]pyrene in vegetable oils and determination by HPLC-FL[J]. Talanta, 2000, 51(6): 1069-1076.

[2]GB3838-2002,地表水环境质量标准[S].

[3]GB5749-2006,生活饮用水卫生标准[S].

[4]阎吉昌，徐书绅，张兰英．环境分析[M]．北京：化学工业出版社，2002.31.

[5]弓玉红，郝 林，郭凯凯.萃取-紫外分光光度法测定土壤中3,4-苯并芘含量[J].山西农业科学，2012，40(4)：383-385.

[6]王焕锁，王红勇. 双波长薄层层析扫描法测定油脂中苯并 (α)芘[J]. 解放军预防医学杂志，1993，11(6): 432-434.

[7]Santos J L, Aparicio I, Alonso E. A new method for the routine analysis of LAS and PAH in sewage sludge by simultaneous sonication-assisted extraction prior to liquid chromatographic determination [J].Analytica Chimica Acta, 2007, 605(1):102-109.

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[9]者为，夏建军，朱保昆.超高效液相色谱-荧光法检测烟丝中的苯并[a]芘残留[J].化学研究与应用，2011，23(9):1260-1263.

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Research on Determination of Trace Benzo(a)Pyrene in Water by HPLC

LI Min, CAI Yi-sha, HAN Bao-wu, XIA Liang

(NanchongEnvironmentalMonitoringCenter,Nanchong,Sichuan637000,China)

This paper has established an analysis method for the determination of benzo(a)pyrene in water by high performance liquid chromatography(HPLC). Furthermore, this study has found the optimum chromatographic analytical condition, with the fluorescence detector excitation wavelength of 290nm, emission wavelength of 406nm, mobile phase of (acetonitrile)∶(water)=80∶20. Meanwhile, benzo(a)pyrene was in the range of concentration of 0～100μg/L and had a good linear relation. The correlation coefficient was 0.9999, the method detection limit was as low as 0.012ng/L, the method recovery of standard addition was 86.9%～103%, and the precision was 2.7%～4.9%. The results showed that this method with high sensitivity, short analysis time, quantitative accuracy and was suitable for the determination of trace concentrations of benzo(a)pyrene in environmental water and drinking water samples.

High-performance liquid chromatography；Benzo(a)pyrene；chromatographic condition； detection limit

2015-01-26

李敏(1982-)，女，河南商丘人，2008年毕业于四川大学物理化学专业，硕士，工程师，主要从事环境监测及环境生态保护研究。

韩宝武，lmscu@126.com。

X830.2

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1001-3644(2015)04-0071-04