艾灸对脾虚胃溃疡模型大鼠血清TFF及胃黏膜ERK1/2、PCNA的影响

李铁浪，粟艳梅，祁芳，倪伟，张泓*，张雨辰，郭华（.湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南长沙4008；.娄底市中心医院康复科，湖南娄底47000；.湖南省中医院疼痛理疗科，湖南长沙40005）

艾灸对脾虚胃溃疡模型大鼠血清TFF及胃黏膜ERK1/2、PCNA的影响

李铁浪1，粟艳梅2，祁芳1，倪伟1，张泓1*，张雨辰3，郭华1
（1.湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南长沙410208；2.娄底市中心医院康复科，湖南娄底417000；3.湖南省中医院疼痛理疗科，湖南长沙410005）

目的观察艾灸对脾虚胃溃疡模型大鼠血清三叶因子（TFF1、TFF2）、胃黏膜细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）和增殖细胞抗原（PCNA）的影响，探讨艾灸促进胃黏膜增殖修复的可能机制。方法将50只健康SD大鼠随机抽取10只为空白组，其余40只采用苦寒泻下法+无水乙醇灌胃建立脾虚胃溃疡大鼠模型，模型成立后随机分为模型组、四君子汤组、艾灸组和艾灸非穴位组，每组10只。各组予以相应处理，8 d后采用酶联免疫吸附法检测血清中TFF1、TFF2的含量，免疫印迹法检测胃黏膜组织p-ERK1/2蛋白的表达，免疫组化法测胃黏膜细胞PCNA的表达。结果艾灸足三里、中脘等穴能明显提高胃黏膜损伤大鼠血清TFF1、TFF2的含量，增强胃黏膜损伤大鼠胃黏膜组织p-ERK1/2蛋白和PCNA的表达（P＜0.05或P＜0.01）。结论艾灸能促进脾虚胃溃疡大鼠损伤胃黏膜的增殖修复，其可能的机制是通过提高TFF1、TFF2的含量，激活TFF/ERK信号转导通路，增强PCNA的表达有关。

艾灸；胃黏膜增殖修复；三叶因子；细胞外信号调节激酶1/2；增殖细胞抗原

〔Abstract〕ObjectiveToobservetheeffectsofmoxibustiononcontentsofserumtrefoilfactor（TFF1，TFF2），andgastricmucosaextracellularsignal-regulatedkinase1/2（ERK1/2）andproliferatingcellnuclearantigen（PCNA）in spleendeficiencygastriculcerratmodels.Toexplorethepossiblemechanismofmoxibustioninpromotingmucosal proliferation repair.Methods 10 rats were randomly selected from the 50 healthy SD rats，the other 40 rats were built into the spleen deficiency gastric ulcer models by the cold diarrhea down+anhydrous ethanol gavage methods.After modeling，the ratswererandomlydividedintothemodelgroup，Sijunzidecoctiongroup，moxibustiongroupandnonacupoint-moxibustion group，10 in each group.The serum contents of TFF1 and TFF2 were detected by ELISA，the expression of gastric mucosa p-ERK1/2 protein was measured with Western blot，and the expression of gastric mucosa PCNA was determined by immunohistochemical method.Results Moxibustion Zusanli and Zhongwan points can significantly improve contents of TFF1 and TFF2 in rats with injury gastric mucosa，increase the expression of gastric mucosa p-ERK1/2 protein and PCNA in rats with injury gastric mucosal（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Moxibustion can promote the proliferation and repair of injury gastric mucosal in spleen deficiency gastric ulcer rats.The mechanism may be related with increasing the contents of TFF1 and TFF2，activating TFF/ERK signal transduction pathway，and enhancing the expression of PCNA.

〔Keywords〕moxibustio；mucosalproliferationrepair；trefoilfactor；extracellularsignal-regulatedkinase1/2；cell proliferation antigen

胃黏膜损伤后增殖修复是由多因素介导，并相互影响而形成的一个复杂的网络体系。三叶因子家族（trefoil factor，TFF）是一群主要由胃肠道黏液细胞分泌的对胃黏膜修复与重建有重要作用的小分子多肽［1］，已有文献证实，在大鼠胃溃疡的愈合过程中，ERK1/2活性显著增强，而阻断这一通路胃溃疡的愈合过程明显延缓［2］。增殖细胞核抗原（PCNA）合成水平反映了细胞增殖率及DNA合成率，是反映细胞增殖状态的直接量度指标［3］。大量临床报道证实艾灸对脾虚胃溃疡有很好的疗效［4-5］，其机制可能是通过提高TFF1、TFF2、ERK1/2、PCNA的表达，促进胃黏膜损伤后的增值修复，以起到对胃溃疡的治疗作用［6-7］。本实验通过对TFF/ERK信号转导途径中的TFF、ERK1/2以及他们之间相关性的研究，以期部分探讨艾灸对脾虚胃溃疡大鼠胃黏膜细胞增殖的调节机制。

1　材料与方法

1.1实验动物

健康Sprague-Dawleyy大鼠50只，体质量200～250 g，雌雄各半，SPF级，饲养温度20～25℃，湿度50%～70%，湖南中医药大学动物实验中心提供（动物质量合格证编号：4304701041）。大鼠适应性饲养1周后用于本实验。

1.2主要试剂和仪器

1.2.1主要试剂及药品SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒、TFF1、TFF2酶免试剂盒、兔抗大鼠ERK1/2抗体、兔抗大鼠PCNA多克隆抗体均由长沙市岳麓区维泰实验用玻璃仪器经营部提供。四君子汤：由人参、白术、茯苓、炙甘草（由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供）组成，按照9∶9∶9∶6比例配制，配成含生药0.233 g/mL的四君子汤药液；太极灸：直径7 mm，高1 cm（河南南阳市卧龙汉医艾绒厂）。

1.2.2主要仪器820型薄片切片机（美国型AO公司）；TGL16M台式高速冷冻离心机（长沙科威实业有限公司）；QL-901旋涡混合器（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；DYY-6C电泳仪、DYCZ-24EN电泳槽、DYCz-4OA转膜仪（北京六一）；a85-1x磁力搅拌器（金坛荣华仪器有限公司）。

1.3动物分组及造模

50只大鼠随机抽取10只为空白组。其余40只大鼠用200%的大黄浓缩液4℃灌胃，1 mL/100 g体质量，每天2次，连续14 d，建立脾虚模型。大黄灌胃第14天，大鼠禁食24 h后，用灌胃针将无水乙醇注入大鼠胃腔内，注入剂量为0.6 mL/100 g体质量，建立胃溃疡模型。模型成立后，再按随机数字表法分为模型组、艾灸穴位组（下称艾灸组）、艾灸非穴位组（下称非穴组）和四君子汤组，每组10只。1.4施治方法

1.4.1穴位定位动物穴位定位法及拟人对照法定位参照林文注主编《实验针灸学》［8］，以胸锁联合和耻骨联合连线下1/4与上3/4交点为肚脐。足三里：膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处；中脘：脐与胸骨剑突连线中点，约脐上20 mm处；脾俞：第十二胸椎下，旁开5 mm；胃俞：第十三胸椎下，旁开5 mm。足三里非穴对照点：膝关节后内侧，在胫骨内侧髁约5 mm处；中脘非穴对照点：中脘旁开1 cm；脾俞、胃俞非穴对照点：与脾俞、胃俞平行后正中线旁开1 cm。

1.4.2实验步骤除空白组外，大鼠造模结束后给予大黄浓缩液致虚，同时各组给予相应的处理：所有大鼠捆缚于鼠板，空白组、模型组、四君子汤大鼠不予施灸；艾灸组、非穴组分别大鼠捆缚固定于鼠板上施灸，将艾柱黏于穴位或对照点施灸，选穴如下：（1）艾灸组：①足三里（双）、中脘；②脾俞（双）、胃俞（双）。（2）非穴组：①足三里对照点（双）、中脘对照点；②脾俞对照点（双）、胃俞对照点（双）。两组每天取1组穴位施灸5壮（约30 min，①、②交替进行），连续8 d。四君子汤组每天每只予以四君子汤8 mL/kg灌胃，其余组则分别灌服同等换算体表面积的生理盐水，每天2次，连续8 d。

1.5取材及检测方法

实验治疗结束后，用20%乌拉坦以10 mL/kg腹腔注射麻醉，剖腹后，将胃的幽门部和贲门部用止血钳结扎，快速用一次性负压采血针从腹主动脉采血5 mL置于37℃恒温水浴箱30 min，4℃低温离心，3 000 r/min，离心15 min，离心后取上清液置于-20℃冰箱保存，釆用酶联免疫吸附法（ELISA）测血清TFF1、TFF2的含量。在两结扎线的两端切断食道及十二指肠，摘下全胃。沿胃大弯剖开，用冰生理盐水冲洗，取胃组织损伤明显处一小块（5 mm×10 mm），然后放入40 g/L多聚甲醛中4℃固定24 h后，用免疫组化法测胃组织中PCNA的表达。另取一小块（10 mm×10 mm）入液氮冷冻存于-80°冰箱保存，用Western Blot法检测胃组织中磷酸化ERK1/2的蛋白表达。其中TFF1、TFF2、p-ERK1/2由长沙高新开发区原点生物技术部检测，PCNA由湖南中医药大学基础组胚实验室检测，详细步骤均按试剂盒说明书严格操作。

1.6统计学分析

所有数据使用SPSS 16.0软件进行处理。所有测量数据用“x±s”表示，资料进行正态性检验：符合正态分布者，多组计量资料采用单因素方差分析，方差齐者用LSD和SNK法，方差不齐者用Tamhane’s T2或Dunnett’s T3法；不符合正态分布者采用多组资料的秩和检验（H检验）。

2　结果

2.1艾灸对脾虚胃溃疡大鼠TFF1、TFF2的影响

与空白组相比，其他各组大鼠血清TFF1、TFF2明显升高（P＜0.01）；与模型组相比，四君子汤组、非穴组、艾灸组大鼠血清TFF1、TFF2明显提高（P＜0.01）；与非穴组相比，艾灸组、四君子汤组大鼠血清TFF1、TFF2明显升高（P＜0.01）；艾灸组与四君子汤组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

表1　各组大鼠TFF1和TFF2的比较（±s，n=10）

表1　各组大鼠TFF1和TFF2的比较（±s，n=10）

注：与空白组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与艾灸非穴组比较☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。下表同。

组别空白组模型组四君子汤组非穴组艾灸组TFF1（ng/mL）3.52±0.19 4.20±0.24△△7.67±0.20△△▲▲☆☆4.74±0.14△△▲▲7.80±0.22△△▲▲☆☆TFF2（pg/mL）52.89±2.14 67.27±2.71△△129.50±3.03△△▲▲☆☆78.94±2.97△△▲▲131.10±4.37△△▲▲☆☆

2.2艾灸对脾虚胃溃疡大鼠ERK1/2及PCNA的影响

与空白组相比，其他各组大鼠胃黏膜ERK1/2 及PCNA含量提高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组相比，四君子汤组、非穴组、艾灸组大鼠胃黏膜ERK1/2 及PCNA含量升高（P＜0.05或P＜0.01）；而与非穴组相比，艾灸组、四君子汤组大鼠胃黏膜ERK1/2及PCNA含量明显提高（P＜0.05或P＜0.01）；艾灸组与四君子汤组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2及图1～2（图2见封三彩图）。

表2　各组大鼠ERK1/2及PCNA的比较（±s，n=10）

表2　各组大鼠ERK1/2及PCNA的比较（±s，n=10）

组别空白组模型组四君子汤组非穴组艾灸组ERK1/2 0.383±0.073 0.444±0.063△0.656±0.111△△▲▲☆☆0.539±0.079△△▲▲0.698±0.121△△▲▲☆☆PCNA（平均光密度）0.160±0.041 0.222±0.037△0.355±0.064△△▲▲☆0.283±0.091△△▲0.365±0.083△△▲▲☆☆

图1　各组大鼠p-ERK1/2蛋白磷酸化水平凝胶电泳图

3　讨论

TFF1主要在胃体及胃窦黏膜上皮表面细胞分泌表达；研究发现TFF1与细胞迁移、增殖、分化、血管形成等密切相关［9］。TFF2主要在胃体、胃窦和十二指肠下段特异性表达，张绍荣等［10］利用PCR技术发现hTFF2能促进实验性大鼠胃溃疡黏膜上皮细胞增殖和溃疡底部血管生成。ERK是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家庭的重要成员之一，有ERK1和ERK2两种亚型，磷酸化的ERK是ERK的活性形式，能激活转录因子，促进基因的表达，参与细胞生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等多种生理过程，对于细胞周期的运行和基因表达具有重要的调控作用［11］。刘晓玲等［12］研究发现补中益气汤通过上调TFF1、EGFR的表达来激活MEK/ERK信号传导途径，从而促进细胞迁移、增殖或分化。国外新近研究发现，TFF2能通过EGFR/MAPK信号传导通路来刺激胆管癌细胞的增殖［13］。增殖细胞核抗原（PCNA）是一种细胞周期调节蛋白，PCNA的出现与细胞增殖周期密切相关，G1期PCNA逐渐增多，S期达高峰，它能准确地反映细胞的生长速度和状态［14］。胃黏膜PCNA的表达能较准确的反映胃黏膜损伤和修复过程中胃黏膜细胞的增殖活性。在国外有学者揭示了TFF与PCNA之间的紧密的联系，Amaguchi H等［15］研究发现，大鼠胃黏膜损伤后胃黏膜肌层的TFF2阳性细胞会伴有细胞核增殖抗原（PCNA）阳性。这与本次实验结果一致：大鼠胃黏膜损伤后，其胃黏膜PCNA上升，且上升趋势与TFF1、TFF2及ERK1/2一致，说明大鼠胃黏膜损伤后有一定的自行愈合修复功能，并启动了细胞增殖活动。

研究发现四君子汤对胃溃疡模型大鼠有显著的防治作用，其能加强胃黏膜损伤大鼠后的黏膜增值修复已从表皮生长因子（EGF）、胞外信号调节激酶（ERK）等途径被证实［16-17］。本研究发现四君子汤与艾灸均能明显上调TFF1、TFF2、ERK1/2及PCNA的表达水平，提示艾灸、四君子汤对胃黏膜损伤大鼠后胃黏膜增殖修复有较好的调控：启动黏膜修复机制，增强ERK1/2蛋白磷酸化，从而使胃黏膜PCNA的含量上升，进而到达加强黏膜损伤后增殖修复的效应。且艾灸穴位的综合效应优于艾灸非穴对照点，表明足三里、中脘等穴具有一定的腧穴特异性。而艾灸穴位的综合效应与四君子汤虽无明显差异，但艾灸组TFF1、TFF2、ERK1/2及PCNA表达的趋势均略高于四君子汤组。临床中艾灸能避免四君子汤煎煮的繁琐，方便易行，且艾灸的温热效应能给病人带来舒适感，故值得临床大力推广。

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（本文编辑匡静之）

Effect of Moxibustion on Serum TFF and Gastric Mucosa ERK1/2 and PCNA in Gastric Ulcer Model Rats with Spleen Deficiency Symptom

LI Tielang1，SU Yanmei2，QI Fang1，NI Wei1，ZHANG Hong1*，ZHANG Yuchen3，GUO Hua1
（1.College of Acumox and Tuina，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2.Department of Rehabilitation，Loudi Central Hospital，Loudi，Hunan 417000，China；3.Department of Pain and Physiotherapy，Hunan Hospital of TCM，Changsha，Hunan 410005）

R245.81

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.02.017.049.04

2014-11-25

国家自然科学基金项目（81173327）；湖南省自然科学基金项目（13JJ6060）；湖南省教育厅创新平台项目（11K047）。

李铁浪，男，副教授，硕士研究生导师，研究方向：针灸治病机制的研究。

*张泓，男，教授，博士研究生导师，E-mail：zh5381271@sina.com。