重组蛋白质的分离纯化研究

梁雅丽 赵邑 郝冬亮

(1.山西省生物研究所基因工程药物实验室 山西太原 030006;2.中国环境干部管理学院 河北秦皇岛 066102)

自20世纪70年代分子生物技术诞生以来,重组蛋白分离纯化技术得到了一定发展,发展重心在优化蛋白质纯化步骤、纯度、节省成本等方面。研究重组蛋白质分离纯化技术能在一定程度上促进重组蛋白分离纯化技术的发展,极具现实意义。

1 准备和预处理样品

样品准备受重组蛋白可溶性的影响。从包涵体力回收蛋白质首先要做的就是细胞裂解,一般使用超声/高压匀浆或是研磨,通过增加能量、流量以及时间来减少细胞碎片。另外,预处理也是减少细胞碎片必不可少的环节,如在高压匀浆前要做好加热和酶预处理工作,促使杆菌释放热稳定酶;通过预处理酵母和假丝酵母酶提升细胞破碎效果;低压均将缩短时间、降低能耗以及减少细胞碎片;通过洗涤包涵体和整合细胞破碎达到优化下游程序目的。

2 层析技术

2.1 层析方法

很多蛋白质纯化方案都是基于多步骤层析方式次序排列之上的,但有些时候一些步骤是可以省略的。蛋白质与多肽作为结构可变及功能繁多的分子,层析行为也具有复杂性,所以要慎重选择基质。复杂蛋白质的纯化仅使用单一层析方法不能满足需求,在不具备标准条件的情况下,只有多选择多试用。Wu等借助SP琼脂糖FF对分泌重组内源血管产生的抑制因子实施了离子交换层析,借助琼脂糖-肝素Hi-Trap对其实施了亲和层析纯化,分离出纯度为98%的蛋白质。Wang等借助CHO-GS系统实现嵌合抗体的表达,再用亲和层析方式得到纯度为91%的蛋白质,然后再用反相高性能液体色谱法实施进一步纯化,得到纯度在99%以上的蛋白质。

在液相层析技术里,当前研究重点是如何改进纯化操作系统性能以强化载体介质性能。此外,灌注层析、置换层析、扩张柱床吸附等技术都在不断发展。

就下游纯化过程而言,可以使用陶瓷羟磷灰石代替离子交换与疏水相互作用。Stok等在芽孢杆菌里表达BI,具体纯化步骤为先进行离子交换,然后进行凝胶过滤,最后进行羟磷灰石层析。Wada等基于杆状病毒表达系统之上通过微粒体形式对重组环前列腺素合酶进行表达,经由磷酸钙凝胶吸收,以及DEAD-琼脂糖和羟磷灰石柱层析纯化,最后获得重组环前列腺合酶。此外,戴文氏杆菌致死因子融合蛋白质纯化,运用苯基琼脂糖→Q-琼脂糖→羟磷灰石三种层析步骤,得到纯度高于95%的蛋白质[1]。

2.2 亲和层析

传统亲和层析就是用单(多)克隆抗体为亲和配基,但在亲和配基前必须要对单克隆抗体进行纯化处理。Wagner等借助哺乳动物表达系统,把马的IgG1重链恒定区作为马细胞因子表达的检测和纯化标签。

在亲和标签里,亲和配基特异性比较低。如锌、铜等金属离子在蛋白质里与组氨酸残基两者结合,组氨酸残基数不同的蛋白质就会被金属离子亲和过程分离。要增加亲和配基特异性,可在蛋白质C端增加组氨酸数量。纯化蛋白质之后,就可切除组氨酸尾巴。Fang等重组了6xHis-VacⅢ基因并在E.实现表达,表达的His融合蛋白质存在形式基本上都是包涵体。Chatterjee等分析了构建在蛋白质C(N)端结合6组氨酸或Sterptag标记的表达载体,并表达L-2羟基酮脱氢酶,借助辅助因子或重组烟草蚀刻病毒蛋白质达到消除标记的目的[2]。纯化时用固定金属或Sterptactin进行亲和层析,通过rTEV达到消除组氨酸标记的目的,促使L-2羟基酮脱氢酶获得完全活性。

基于共价键之上,染色配基与亲和基质能实现紧密连接,它们可能具有毒性,但和蛋白质的相互作用属于非特异性,容易把一种染色配基与特定目的蛋白质联系起来,但得到的税收产物纯度不高。相较于抗体,肽链属于稳定性更高的配基,而且还具备特异性;相较于燃料,肽链没有毒性。肽链与蛋白质相互作用具备温和性,产生的洗脱分离条件也具备温和性,肽链数据能经由噬菌体生成或化学合成,在噬菌体肽链数据库里,给定长度的随意一个基因片段被合成,接着再插进噬菌体基因里,确定肽链顺序之后,就可以进行化学合成,并将其固定在支持物上面。一般来说,融合蛋白质具有易纯化的特点,用于蛋白质纯化的标记有很多,如聚组氨酸、聚精氨酸等,参与亲和纯化的蛋白质融合伙伴也有很多,如蛋白质A和乳糖抑制物等。重组人胰高血糖素样肽-1经过高密度发酵之后,培养出的菌体超声波破碎后就用Glutathione-Sspharose4B裂解液实施亲和层析,获得GST融合蛋白质,接着再经由CNBr裂解和QAESspharose柱层析与脱盐两个步骤,获得纯度高于90%的人胰高血糖素样肽-1。

生物学活性分析表明:人胰高血糖素样肽-1有明显的降血糖活性。Lu等基于pGEX-6p-3之上,利用E.表达APXa与PAXb两种大米抗坏血酸过氧化酶APX基因。APX的表达形式是GST融合蛋白质,借助谷胱甘肽琼脂糖4B实施亲和层析,分别获得产量40毫克和73毫克。

来源于环状芽孢杆菌WL-12的壳聚糖酶A1壳聚糖结合区的组成是45个氨基酸,是壳聚糖特异性的有效体现。壳聚糖结合区和乙内酰脲酶基因编码区的C端相融合,以E.为载体进行表达,产物中可溶性蛋白质含量为8%。经由SDS-PAGE分析,表明融合蛋白质和亲和介质两者的连接具有较高的稳定性、特异性及可逆性。

3 结语

重组蛋白质的分离纯化是一项十分系统和复杂的技术,除了本文论述的层析技术之外,还可以通过冻融循环实现大肠杆菌胞质里重组蛋白的有效分离。在信息化时代,未来重组蛋白质分离纯化技术将会朝着全自动化、高分辨率等方向发展。

[1]牛瑞,秦胜利.蛋白质分离纯化技术研究进展[J].化工科技市场,2010(04):16-18.

[2]吕微,蒋剑春,徐俊明.蛋白质提取及分离纯化研究进展[J].精细石油化工进展,2010(11):52-56.