超声波法辅助提取荸荠块茎皮中甾醇的工艺研究

卢敏等

摘要：采用超声波法提取荸荠[Heleocharis dulcis （Burm. f.） Trin.]块茎皮中的甾醇，对提取溶剂的种类、溶剂体积分数、料液比、提取时间、超声波功率分别进行单因素试验，并在此基础上利用Box-Benhnken中心组合试验和响应面分析法确定了植物甾醇提取的最佳工艺。结果表明，荸荠块茎皮中甾醇的最佳提取工艺条件为60%乙醇、料液比为1∶40（g∶mL）、提取时间为14 min、超声波功率为600 W，实际测得的植物甾醇的紫外吸光度为1.375。

关键词：荸荠[Heleocharis dulcis （Burm. f.） Trin.]；超声波；甾醇；响应面法

中图分类号：S645.3；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）12-2987-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.047

Study on Phytosterols Extraction from Chufa Tubers Leather by Ultrasonic Method

LU Min，YANG Zhi-gang， LUO Bing，SUN Hai-yan

（Department of Bioengineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500， Jiangsu，China）

Abstract：Using the method of ultrasonic to extract phytosterols from chufa tubers leather， based on single factor experiment， the factors which affected the amount of phytosterols including extraction solvent， alcohol concentration， the ratio of solid to liquid， extraction time and ultrasonic power were studied by Box-Benhnken center combination experiment and the response surface method. The results showed that the best technological conditions of phytosterols extraction from chufa tubers leather were alcohol concentration 60%， the ratio of solid to liquid 1：40， extraction time 14 min， and ultrasonic power 600W. Under the conditions， the ultraviolet spectrophotometer absorbance was 1.375.

Key words： Chufa； ultrasonic；Phytosterols； response surface method

荸荠[Heleocharis dulcis （Burm. f.） Trin.]属莎草科（Cyperaceae）多年生水生草本植物，生长于池沼中或栽培在水田里。具匍匐茎，先端膨大为球茎。古称凫茨，又称乌芋、马蹄、地栗，是中国典型的传统中药，具有药膳同源之功效，不仅质脆味佳，营养丰富，而且能清心降火、补肺凉肝、消食化痰、破积滞、利脓血等。《中药大辞典》上记载荸荠中含有抑菌成分-马蹄英，该物质对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及产气杆菌均有抑制作用[1]。还有报道发现荸荠的各种制剂在动物体内均有抑制肿瘤细胞生长的作用[2]。

植物甾醇是一类以环戊烷全氢菲为骨架的天然醇类化合物。天然植物甾醇种类繁多，主要包括β-谷甾醇、豆甾醇、菜子甾醇和菜油甾醇4种无甲基甾醇[3]。植物甾醇主要存在于油脂中，特别是精炼油后的脱臭馏出物中含量较大，所以在大多数已报道的研究中，一般都以脱臭馏出物作为提取原料，用不同的方法加以提取[4-8]。甾醇属天然物质，本身无毒性，且具有乳化性和稳定性等特点，因此在医药、食品、化妆品、动物生长剂、植物生长激素及化工、纺织等领域都得到广泛应用[9]。植物甾醇提取方法有多种，常见的提取方法有溶剂结晶法、络合法、皂化法、蒸馏法（简单蒸馏法、分子蒸馏法）、吸附法（柱吸附法、高压流体吸附法）、超临界CO2萃取法、酶法等[10，11]。近年来也有使用超声波法提取植物甾醇的研究报道[12，13]。本研究采用超声波法提取荸荠块茎皮中的植物甾醇并确定其最佳工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荸荠：产地为苏州，购于农贸市场；植物甾醇混合标准品：上海奥宇生物科技有限公司；无水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚（均为分析纯）；试验用水为去离子水。

1.2 仪器设备

LP502B型电子天平、TU-1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用器材有限公司）、DFT-200型高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司制造）、FQ-IID型超声波细胞粉碎机（南京菲齐工贸有限公司）、202-3型烘箱（上海实验仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理 将荸荠洗净削皮，将皮烘干粉碎备用。

1.3.2 最大波长的测定 精确称取20 mg植物甾醇混合标准品，用无水乙醇溶解并定容至25 mL容量瓶，以无水乙醇为空白对照，检测植物甾醇混合标准品的最大紫外吸收波长。

1.3.3 荸荠块茎皮中植物甾醇的提取 准确称取荸荠块茎皮粉末0.5 g，用一定浓度的提取溶剂以一定的料液比在一定的超声波功率条件下提取一定时间后过滤，在50 mL容量瓶内用相应浓度的提取溶剂将滤液定容至50 mL，于检测的最大紫外吸收波长处测定其吸光度。

1.3.4 最佳提取溶剂的确定 在超声波提取条件下，选取几种常用溶剂进行比较试验。固定条件：提取时间60 min，料液比1∶20（g∶mL，下同），超声波功率600 W。在超声波提取条件下，选用无水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚进行提取，确定最佳提取溶剂。

1.3.5 单因素试验 精确称取荸荠块茎皮粉末0.5 g，以“1.3.4”确定的最佳溶剂为提取溶剂，分别考察不同体积分数的提取溶剂（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）；提取时间（5、10、15、20、25 min）；超声波功率（200、300、400、500、600 W）对植物甾醇提取的影响。

1.3.6 响应面法试验 在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计，以紫外吸光度为响应值，选取对甾醇提取影响较大的单因素进行响应面试验，通过回归方程和方差分析确定最佳提取工艺，并对最佳条件进行验证试验。统计分析软件为Design-Expert 7.0专业版本。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 最佳提取溶剂的选择 4种提取溶剂对吸光度的影响见图1。由图1可知，以无水乙醇作为提取溶剂时，荸荠块茎皮中植物甾醇的提取量最高，吸光度达到0.497，其次是正己烷，其吸光度为0.217，两者相差较大，故将无水乙醇作为提取溶剂。

2.1.2 乙醇体积分数 乙醇体积分数对荸荠块茎皮中植物甾醇提取的影响见图2。由图2可知，当乙醇体积分数小于60%时，植物甾醇的吸光度随着乙醇体积分数的增大而增大，而当乙醇的体积分数大于70%时，植物甾醇的吸光度随着乙醇体积分数的增大而减小。这是由于不同体积分数的乙醇极性和挥发性不同，植物甾醇具有活性基团—羟基，能与乙醇和水形成氢键，而当乙醇体积分数太大时，乙醇挥发损耗大，吸光度会降低。

2.1.3 料液比 料液比对荸荠块茎皮中植物甾醇提取的影响见图3。由图3可知，当料液比大于1∶40时，植物甾醇的吸光度随着料液比的降低而增大，这主要是由于随着料液比的降低，荸荠块茎皮粉末被稀释，植物甾醇就容易渗透出来；但是当料液比小于1∶40时，植物甾醇的吸光度却随着料液比的降低而减少，这主要是因为受试验条件所限，超声波提取时烧杯口是敞开的，料液比降低，溶剂损耗增大，所以提取量减少，因此，确定最佳料液比为1∶40。

2.1.4 提取时间 超声提取时间对荸荠块茎皮中植物甾醇提取的影响见图4。由图4可知，当超声波提取时间小于15 min时，超声波提取时间越长，植物甾醇的吸光度就越大，但当超声波提取时间超过15 min后，随着超声提取时间的延长，植物甾醇的吸光度反而下降，这是由于随着时间的延长，超声波提取使得乙醇的损耗增加，另一方面也是由于乙醇的挥发导致的损耗。因此超声波提取时间应选择在15 min左右。

2.1.5 超声波功率 超声波功率对荸荠块茎皮中植物甾醇提取的影响见图5。由图5可知，当超声波功率小于500 W时，超声波功率越大，植物甾醇的吸光度就越大，这是因为超声波功率越大，细胞分子运动加剧，加速了有效成分的溶解和释放，所以植物甾醇的吸光度增大，但当超声波功率大于500 W时，随着超声波功率的增大，植物甾醇的吸光度反而下降，这或许是因为超声波功率增大溶解的杂质的含量也相应增加，从而导致有效成分的提取量下降。

2.2 响应面法试验结果

2.2.1 方程拟合 单因素试验结果表明，料液比、提取时间、超声波功率对荸荠块茎皮中植物甾醇的提取有显著影响。因此，固定乙醇体积分数为60%，通过响应面分析对料液比、超声波时间、超声波功率3个因素进行更深入的研究。分析因素与水平设计见表1，响应面分析方案及试验结果见表2。通过试验软件Design-Expert 7.0将表2的结果进行拟合，得到了按实际值计的拟合方程：

Y=-3.232 30+0.145 53A+0.177 12B+0.001 57C+0.000 455AB+0.000 019 2AC-0.000 008 5BC-0.002 062 25A2-0.006 909B2-0.000 001 722 5C2。试验的方差分析见表3。由表3可知，方程的F值为5.00，F>f0.05（9，7）=3.29，说明因变量和全体自变量之间的线性关系显著；模型的R2=0.963 8，说明拟合程度较高，即试验方法是可靠的。在所选取的各因素水平范围内，对结果的影响排序为料液比<超声波功率<提取时间。用超声波法提取荸荠块茎皮植物甾醇的最佳工艺条件为乙醇体积分数为60%，料液比1∶39.6，提取时间为13.7 min，超声功率为600 W，理论吸光度为1.383。

2.2.2 响应面图 响应曲面及其等高线见图6至图8。由图6至图8可看出，3个响应面均为开口向下的凸曲面， 3个因素与甾醇吸光度呈抛物线关系，且在考察范围内存在响应值的极值。采用上述最优提取条件进行荸荠块茎皮中植物甾醇提取试验，同时考虑到实际操作的便利，将条件修正为乙醇体积分数为60%、料液比为1∶40、提取时间为14 min、超声波功率为600 W，实际测得提取的植物甾醇紫外吸光度为1.375，与理论预测值相比，相对误差是0.58%。因此，采用该法优化得到的工艺条件参数准确可靠，具有使用价值。

3 小结

60%的乙醇为超声波提取荸荠块茎皮中植物甾醇的理想溶剂，响应面优化得到的最佳提取工艺条件：料液比为1∶40，提取时间为14 min，超声功率为600 W，0.5 g荸荠块茎皮粉末提取的植物甾醇的紫外吸光度达到1.375，与理论值相对误差为0.58%。

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