蒙古绵羊Bcl-2基因cDNA的克隆及序列分析

郭宏儒　（内蒙古民族大学动物科技学院　内蒙古 通辽　028043）　任秀珍　（内蒙古民族大学农学院）　曹贵方　（内蒙古农业大学动物胚胎与发育生物学研究室　内蒙古 呼和浩特）

蒙古绵羊Bcl-2基因cDNA的克隆及序列分析

郭宏儒（内蒙古民族大学动物科技学院内蒙古 通辽028043）任秀珍（内蒙古民族大学农学院）曹贵方*（内蒙古农业大学动物胚胎与发育生物学研究室内蒙古 呼和浩特）

摘要为扩增蒙古绵羊bcl-2基因全序列，根据GenBank上已公布的牛的序列，设计了3条引物。从蒙古绵羊脾中提取总RNA,采用RT-PCR，技术扩增出bcl-2的cDNA，并重组到pBlueselectT载体，经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定，证实所克隆的cDNA为bcl-2，因为该cDNA 包含由687个碱基组成的开放读码框（ORF），该ORF 编码229个氨基酸。经比对，与牛的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为95.5%和93.4%。

关键词绵羊Bcl-2基因克隆序列分析cDNA

1972年，Kerr等提出细胞凋亡的概念，细胞凋亡（apoptosis）又谓细胞程序化死亡（programmed cell death，PCD）是一种参与了生物体许多过程的细胞去除机制，是由基因编程调控的细胞主动自杀过程。抗凋亡基因BCL2家族的发现开辟了新一类癌基因—凋亡调控基因的新纪元［1］。Bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，并用近年来的一些研究已开始揭示这一作用的机制。目前已经发现的Bcl-2蛋白家族按功能可分为两类，一类是象Bcl-2一样具有抑制凋亡作用，如哺乳动物的Bcl-X1、Bcl-W、Mcl-1、A1、线虫Ced-9、牛痘病毒E1B119kD等，而另一类具有促进凋亡作用，如Bax、Bcl-Xs、Bad、Bak、Bik/Nbk、Bid和Harakiri［2］。

1　材料与方法

1.1试验对象及组织

蒙古绵羊取自于内蒙古穆斯林屠宰场。取新鲜脾脏液氮保存备用。

1.2药品与试剂

琼脂糖、溴乙锭、总RNA提取试剂盒（Cat.NO.Z5110）购自Promega公司。反转录RT-PCR试剂盒（Cat.NO.DRR0 19A）、5′RACE试剂盒（Cat.NO.D315）、PCR产物纯化试剂盒、限制性内切酶Hind Ⅲ和XbaⅠ、T4连接酶、TaKaRa ExTaq DNA Polymerase、DNA Marker为DL2000 （分子量为2000，1000，750，500，250，100）、PMD18-T载体；质粒提试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司；E.coli JM109 感受态细胞实验室是保存。

1.3PCR引物的设计与合成

1.3.1bcl-2 cDNA 3′RACE引物3′RACE用引物：反转录引物（RT-Primer）为试剂盒提供的Oligo dT-Adaptor Primer，该引物含有TaKaRa独特设计的dT区域及M13 Prime M4部分P2（5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′）。根据本研究通过RT-PCR已获得蒙古绵羊Bcl-2的大部分序列和引物设计原则，并借助计算机软件DNAstar进行辅助设计，设计了一条特异性引物P1（5′-TCATGTGTGTGGA GAGCCTCAA-3′）作为上游引物，下游引物为P2。

1.3.2bcl-2 cDNA 5′RACE引物根据已获得蒙古绵羊Bcl-2 cDNA的已知序列设计两条反义引物，正义引物为TaKaRa 5′RACE试剂盒提供。第一对PCR引物的正义引物为P3（5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3′），反义引物为P4（5′-TCACCCCGTCCCTGAAGAGA-3′）第二对PCR引物的正义引物为P5（5′-CGCTCCGGAACAGCCTACTGA TGATCAGTCGATG-3′），反义引物为P6（5′-TTGATTTCT CCTGGCTGTCTC-3′）。各引物由上海生工生物工程技术有限服务公司合成。

1.4蒙古绵羊脾组织总RNA的提取

采用Promega公司的总RNA提取试剂盒，按其说明进行。最后用无RNA酶去离子水溶解RNA沉淀，-70℃保存备用。

1.53′RACE PCR循环

1.5.1cDNA第一条连的合成如上提取蒙古绵羊脾组织总RNA。反转录反应组分总体系为10µl：总RNA4.5µl、10×RT buffer 1µl、MgCl2（25mM）2µl、dNTP Mixture（10 mM）1µl、RNase Inhibiter（40U/µl）0.25µl、AMV Reverse Transcriptase Xl（5U/µl）0.5µl、OligdT（2.5µmol/l）0.5µl、RNase Free dH2O 0.25µl、终体积10µl。反应条件为：30℃10min、42℃30min、95℃5min、5℃5min，将mRNA反转录成cDNA，用作PCR模版。

1.5.2PCR反应PCR反应组分总体系为50µl：上述RT溶液10µl、5×PCR Buffer 10µl、TaKaRa ExTaq（5U/µl）0.25µl、 P1（10pmol/µl）1µl、 P2（10pmol/µl）1µl、 dH2O 27.75µl、终体积50µl。PCR反应条件为：94℃3min、94℃30s、61℃30s、72℃45s，35个循环。

1.5.33′RACE产物的克隆、筛选及鉴定按PCR产物纯化试剂盒先将RT-PCR扩增产物纯化，然后用T4连接酶将纯化的bcl-2基因cDNA片断与PMD18-T载体连接，连接产物转化JM109感受态细胞后，在含X-gal、IPTG的LB平板培养基37℃培养14h。选择白色菌落，用质粒提取试剂盒提取质粒，经Hind Ⅲ和Xba I对质粒DNA进行酶切鉴定。酶切鉴定正确的质粒送大连宝生物工程有限公司进行序列测定。

1.6套式PCR

1.6.1cDNA第一条连的合成将上述提取的RNA按照5′RACE试剂盒说明处理后进行反转录。反转录体系为10µl：Ligated RNA 6µl、Random 9 mers（50µM）0.5µl、5×M-MLV Buffer 2µl、dNTP 1µl、RNase Inhibiter（40U/µl）0.25µl、Reverse Transcriptase M-MLV（200U/µl）0.25µl、终体积10µl。反应条件为：30℃10min、42℃1rh、70℃15min，将mRNA反转录成cDNA，用作PCR模版。

1.6.2套式PCR套式PCR共进行两次PCR反应。Outer PCR反应：上述反转录反应液2µl、1×cDNA Dilution Buffer Ⅱ8µl、5×PCR Buffer 4µl、MgCl2（25mM）3µl、TaKaRa ExTaq（5U/µl）0.25µl、P3（10µM）2µl、P4（10µM）2µl、dH2O28.75µl。总反应体系为50µl。PCR反应条件为：94℃3min、94℃30s、55℃30s、72℃45s、72℃1min，35个循环。Inner PCR反应：Outer PCR反应液1µl、5×PCR Buffer 5µl、MgCl2（25mM）5µl、dNTP Mixture（2.5mM）8µl、 TaKaRa ExTaq（5U/µl）0.5µl、 P5 （10µM）2µl、P6（10µM）2µl、dH2O26.5µl。总反应体系为50µl。PCR反应条件为：94℃3min、94℃30s、57℃30s、72℃45s、72℃1min，35个循环。

1.6.35′RACE产物的克隆、筛选及鉴定采用的方法与1.5.3相同。

1.6.4DNA序列测定将酶切鉴定正确的质粒送大连宝生物工程有限公司进行序列测定。

2　结果

2.13′RACE的扩增

2.1.13′RACE的扩增经2%琼脂糖凝胶电泳检测，3′RACE产物大小为339bp（见图1）。

2.1.23′RACE产物的克隆、筛选及鉴定将3′RACE反应扩增产物与pBlueselect T载体连接筛选后获得阳性克隆，提取质粒DNA后经限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR I双酶切鉴定，证实含有插入的目的片段（见图2）。

图1　bcl-2 cDNA RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

图2　重组质粒PMD18-T-bcl-2限制性酶切分析

2.25′RACE的扩增

2.2.1套式PCR经2%琼脂糖凝胶电泳检测，5′RACE产物大小为434bp（见图3）。

图3　bcl-2 cDNA RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

图4　重组质粒 PMD18-T- bcl-2 限制性酶切分析

2.2.25′RACE产物的克隆、筛选及鉴定将5′RACE反应扩增产物与pBlueselect T载体连接筛选后获得阳性克隆，提取质粒DNA后经限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定，证实含有插入的目的片段（见图4）。

2.33′RACE产物的序列分析

经酶切鉴定正确的质粒送大连宝生物工程有限公司进行序列测定。3′RACE产物测出338个核苷酸序列，该序列包括C端64个氨基酸编码序列、终止密码子TGA、3′UTR 109个核苷酸和poly（A）15。

2.45′RACE产物的序列分析

经酶切鉴定正确的质粒送大连宝生物工程有限公司进行序列测定。5′RACE产物测出434个核苷酸序列，该序列包括C端144个氨基酸编码序列、翻译起始密码子ATG。

2.5bcl-2基因cDNA全长序列分析及同源性比较

在bcl-2 cDNA 部分已知序列的基础上，通过3′RACE 和5′RACE 分别将bcl-2 cDNA 的3′末端和5′末端 扩增完全，得到了806bp的bcl-2 cDNA全序列，并通过DNAstar （Lasergene5.0）推导出228个蛋白质的氨基酸序列（见图5）。

图5　bcl-2 cDNA的核苷酸全序列及228个氨基酸序列

使用DNAstar分析软件MegAlign ClustelW（Slow/Accurate）对bcl-2和其他哺乳动物及禽类的bcl-2进行cDN碱基序列的同源性比较，bcl-2与牛的同源性最高（95.5%），与猫、人、犬、鼠、分别为88.2%、87.8%、83.5%、82.4%，与鸡的同源性最低（52.1%）。这说明绵羊作为反刍动物在bcl-2表达上具有种属特异性。另外使用MegAlign软件对bcl-2和其它动物的bcl-2进行氨基酸序列的生物进化树分析（见图6）。

图6　bcl-2与人及其它动物bcl-2氨基酸序列生物进化树分析

3　讨论

bcl-2是一个多基因家族，目前在哺乳动物中，至少发现15个家族成员，形成同源或异源二聚体，调控蛋白酶和核酸酶活性，双向调节细胞凋亡。其中促进凋亡的有bcl-Xs、bad、bak、bax等，抑制凋亡的有bcl-2、bcl-XL、Bcg-l等［3］，含有种类和数量不同的BH（bcl-2homology）结构域。bcl-2蛋白缺乏特征性信号肽但C末端有一个疏水区，通过其C末端疏水性氨基酸片段锚定于胞膜。以后的研究发现，这种定位和它们的功能密切相关［4］。而且有研究表明bcl-2表达产物可阻止许多刺激物诱发的细胞凋亡［5］。其抑制的可能是细胞凋亡的共同通路。本试验扩增出的bcl-2基因经不同的剪接方式形成2种不同的蛋白质产物，即bcl-2α和bcl-2β，但主要是α形式［6］。不同物种bcl-2α所含的氨基酸数目略有差异，例如鸡233个、人239个、大鼠236个，该蛋白C端有一个由19个氨基酸构成的疏水序列，为跨膜部分。鸡和哺乳动物bcl-2蛋白在C-端和N-端区域是高度保守的，但中间位置的同源性较差。

本研究通过RT-PCR技术，成功地扩增获得了绵羊bcl-2基因的cDNA全序列，其中1～693为编码区的部分序列，694～806为非编码区，这为克隆其他物种bcl-2全序列提供了参考依据。通DNAStar分析软件MegAlign ClustelW （Slow/Accurate）对和其他哺乳动物、人及禽类的bcl-2进行cDNA碱基序列的同源性比较发现，该扩增序列与牛的核苷酸同源性为95.5%，进一步的分析发现该基因的部分编码区与其他物种具有较高的同源性，与猫、人、犬、鼠、分别为88.2%、87.8%、83.5%、82.4%，但与至今所报道的禽类动物相应区域同源性很低，与鸡的同源性为52.1%。非编码区的序列与牛的同源性十分高，而人、鼠相应的非编码区却很相似，都存在一很长的CA串联重复序列。这说明相似物种同一基因在进化过程中更加保守。据报道，非翻译区的遗传改变（碱基突变）引起了bcl-2的过度表达，本研究扩增出的非翻译区序列，可为遗传突变分析提供依据。

目前Bcl-2是凋亡分子机制研究的主要靶分子。随着对Bcl-2基因序列的测定以及凋亡本身研究的日渐深入，有利于对研究该基因在各种动物上的分子调控机制。Bcl-2是作用机制和凋亡的分子机制最终被阐明，从而提高对与凋亡有关的疾病的认识和诊治水平。

参考文献

［1］ Korsmeyer S J. BCl-2 initiate a new category of oncogenes ∶r egulators of cell death. Blood，1992, 80（4）∶ 879-886.

［2］ Brown R. British Medical Bulletin, 1996；53∶466-477

［3］Jimenez G S,Khan SH,Stommel J M,et al. P53 regulation by posttranslational modification and nuclear retention in response to diverse stresses［J］. Oncogene,1999,18 ∶76561

［4］ Za mzami N Brenner G,Marzo I. Permeability transition proe inapoptosis［J ］ .Biosci Rep,1997,17 ∶67 .

［5］ 杨学辉, 刘彦信, 郑德先. bcl-2抑制CD3分子介导的T淋巴细胞凋亡［J］1中国医学科学院学报, 1999, 21（6）∶ 4211.

［6］ Maja T, Markus C, Bernd K. Cloning and functional analysis of cDNA encoding the hamster bcl22 protein ［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, 275∶ 899-903.

中图分类号：S826.8+2

文献标识码：A

文章编号：1007-1733（2015）03-0003-03

收稿日期：（2014–12–08）

*通讯作者