基于卵黄抗体的副溶血弧菌间接ELISA快速检测方法的建立

闫茂仓　胡伟丽　张赛乐　王雪鹏

（①浙江省海洋水产养殖研究所 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室　浙江 温州325005　②温州医科大学生命科技学院，浙江 温州　③宁波大学海洋学院　浙江 宁波　④山东农业大学动物科技学院　山东 泰安）

试验研究

基于卵黄抗体的副溶血弧菌间接ELISA快速检测方法的建立

闫茂仓①③胡伟丽②③张赛乐①王雪鹏④*

（①浙江省海洋水产养殖研究所 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室浙江 温州325005②温州医科大学生命科技学院，浙江 温州③宁波大学海洋学院浙江 宁波④山东农业大学动物科技学院山东 泰安）

摘要本文主要研究了以水产致病性哈氏弧菌为抗原，免疫SPF蛋鸡，制备特异性卵黄抗体，从抗体的提取、纯化等方面进行了进一步的优化研究；建立基于IgY的快速、准确、定量的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗原菌浓度的技术；建立基于IgY的间接ELISA测定抗原浓度的技术方法，确定抗原包被浓度、一抗IgY和酶标二抗最适稀释倍数，抗原包被条件的选择，底物的最佳反应时间等间接ELISA的实验条件。建立了基于IgY的间接ELISA测定哈氏弧菌的方法，试验的最佳反应条件为：抗原最适工作浓度浓度为1×108cfu/ml，包被4℃过夜；一抗IgY稀释度分别为1∶28；购买的兔抗鸡IgY-HRP酶标抗体作1∶20000稀释；选择底物的最佳反应时间为20min。

关键词卵黄抗体副溶血弧菌ELISA快速检测

目前，国内外已经开展了大量弧菌病免疫检测技术的研究，但是大多是采用全菌苗制备多克隆抗体或多克隆抗体而建立的快速检测方法，而以主要致病因子作为免疫原、以卵黄抗体为免疫手段等方法建立的快速检测方法，因其具有较高的专一性和特异性，受到更大的推崇。基于此，笔者用副溶血弧菌全菌苗制备了特异性卵黄抗体，以此为免疫手段，建立间接ELISA检测技术方法，旨在为开展海水养殖动物致病性弧菌的早期快速检测和防控，为海水养殖动物弧菌病的防治奠定基础；以及为海产品食品质量安全控制提供技术支持。

1　材料与方法

1.1IgY的初步分离、提取和纯化

按照参考文献制备。

1.2间接ELISA方法的建立

1.2.1用棋盘式滴定法确定最佳抗原包被浓度和最佳一抗浓度将109cfu/ml浓度的副溶血弧菌作系列10倍梯度稀释至104cfu/ml。每个稀释度包被3个孔、每孔100μL，4℃过夜。一抗IgY初始浓度为1.97mg/ml，依次作系列10倍稀释至1∶1010，酶标抗体做1∶20000稀释，间接ELISA测定。以能产生OD450值为1.0左右，且P/N值（阳性对照OD450值-空白对照OD450值/阴性对照OD450值-空白对照OD450值）最大的抗原稀释度和抗体稀释度作为抗原、抗体最适反应比［1,2］。

1.2.2酶标二抗最适浓度的确定将抗原、一抗稀释至最适反应比，酶标二抗分别稀释为1∶10000、1∶15000、1∶20000、1∶25000、1∶30000，其他条件相同，进行间接ELISA检测。根据P/N值确定酶标二抗的最适浓度。

1.2.3包被条件的选择以最佳抗原包被酶标板，包被条件分别为：37℃1h后4℃过夜；37℃2h后4℃过夜；4℃过夜；37℃2h，一抗IgY、酶标二抗为最佳浓度，其他条件相同，进行间接ELISA检测。根据P/N值确定最佳包被条件。

1.2.4灵敏度评价副溶血弧菌悬液稀释梯度为108、107、106、105、104、103、102cfu/ml 为检测样品，同时做空白对照和阴性对照。通过比较样品和阴性对照OD450值，以P/N值≥2.1为最低检测限。

1.2.5特异性检测用已经建立起的间接ELISA检测常见的致病性海洋弧菌，例如，副溶血弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌。

表1　抗原包被浓度一抗稀释度　　　　（cfu/ml）

2　结果

2.1抗原、一抗最适包被浓度

采用方阵滴定法做抗原和特异性IgY抗体的倍比稀释，ELISA反应结果见表1。从表中可以看出：当抗原浓度为108和109cfu/ml、一抗浓度为1∶28时OD450的值均靠近1.0，但抗原浓度为108cfu/ml时OD450的值较大，所以确定抗原浓度为108cfu/ml一抗浓度1∶28。

2.2二抗HRP最佳浓度

表2　HRP酶标二抗的最佳浓度

从表可以看出：当酶标二抗浓度为1∶15000和1∶20000时，阳性值最接近1.0，而只有在1∶20000P/N值最大，所以确定HRP酶标二抗最佳工作浓度为1∶20000。

2.3包被条件

选择37℃1h后4℃过夜、常温1h后4℃过夜、4℃过夜、37℃2h，4种不同的包被条件，测OD值见表3。

表3　不同包被条件

从表3可以看出，当包被液的包被条件为37℃2h时值最接近1.0，且P/N值最大。

2.4灵敏度

副溶血弧菌悬液的稀释浓度依次为108、107、106、105、104、103、102cfu/ml，各项条件均为最佳条件，进行间接ELISA检测OD450值，能检测到103cfu/ml的副溶血弧菌，灵敏度高。

2.5特异性

用已经建立起来的间接ELISA检测几种常见的致病性海洋弧菌及常见细菌：副溶血弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。 发现只能检测到副溶血弧菌，其他细菌皆为阴性，表现出了较高的特异性。

3　讨论

ELISA方法是利用抗体的选择性和酶标记的化学放大的灵敏性而建立起来的，其反应条件是影响检测结果的重要因素。本实验是利用自制免疫的特应性IgY建立间接ELISA法检测抗副溶血弧菌实验过程中，对包被抗原及一抗的浓度、包被缓冲液及包被条件、封闭缓冲液及封闭时间、酶标二抗的稀释度、酶标抗体作用的时间、底物作用的时间等实验条件进行了优化。本试验为利用免疫学方法检测抗原菌奠定了基础。

3.1包被抗原浓度及包被条件对ELISA检测方法的影响

包被液中的蛋白质浓度在0.1～2000mg/L，均能吸附在聚苯乙烯塑料板上，但浓度过高时蛋白质分子间的相互作用力妨碍了聚苯乙烯载体表面与蛋白质的吸附，在ELISA测定法操作的一系列温育、洗涤过程中，固相吸附的蛋白质不断地被释放到液相中去，造成实验的非特异性。但是如果包被液中蛋白质浓度过低，固相载体表面不能被蛋白质完全覆盖，相继加入的待测标本和酶结合物的蛋白也部分的非特异性的吸附于聚苯乙烯表面，最后产生的非特异性显色而影响检测结果。为避免这些问题，必须选择最适包被蛋白浓度，即吸光度为1.0左右，但P/N值最大。本实验证明，选用全菌抗原稀释到108cfu/ml时，P/N值最大，试验特异性较高。进行ELISA实验时，包被的质量是影响抗原-抗体反应的重要因素。其中，包被温度与时间对结果影响很大，如果温度低则相应延长包被时间；相反，温度高，则可缩短包被时间。通常认为4℃包被过夜与37℃包被2h具有相同的包被效果。本试验采用的是4℃包被过夜。

3.2间接ELISA法在基于IgY应用于检测弧菌的优缺点

随着免疫学检测技术的出现，ELISA方法已发展成较成熟的检测技术。ELISA方法的最大特点就是利用聚苯乙烯微量反应板吸附抗原或者抗体，使之固化，在其中进行免疫反应和酶促反应，而且可同时对大量样品进行处理和检测。此方法具有选择性好、操作简便、灵敏度高、价格便宜、实用性强等优势，弥补了经典化学方法和其他一起测试手段的不足，正因为以上优势而广泛的应用到很多领域中能对样品进行定性、定量和半定量的测定。虽然ELISA检测方法具有很多优点，但是也存在一些不足，例如样品较多的时候，加样品和洗涤的过程中，如果没有多孔加样器或者实验者操作手法不熟练，势必造成首先添加和最后添加的孔操作时间上相差许多，造成结果平行性不好和不准确，操作时需要注意此方面的影响因素从而安排好实验量；酶标抗体及其他抗体的主要成分都是蛋白质，切忌反复冻融使蛋白质变质而失去了其活性功能，所以要分装保存，试验出现不良结果时，要考虑是否是由于酶标抗体或其他抗体保存不当而使其失活而造成的。

参考文献

［1］ 吴后波, 潘金培. 海水养殖真鲷弧菌病病原菌外毒素的点酶法检测［J］. 水产学报, 2003, 27（6）∶ 606-609.

［2］ 鄢庆枇, 方恩华, 苏永全等. 大黄鱼溶藻弧菌LPS的间接ELISA检测［J］. 台湾海峡, 2004, 23（1）∶ 56-61.

［3］ Davey M L, Hancock R E W, Mutharia L M. Influence of culture conditions on expression of the 40 kilodolton porin protein of Vibrio anguillarum serotype O2［J］. Appl. Enciron. Microbiol., 1998,64∶ 138-146.

中图分类号：S852.4+3

文献标识码：A

文章编号：1007-1733（2015）03-0001-02

收稿日期：（2014–11–17）

基金项目：浙江省科技计划项目（2012C22072，2012F20029，2009F20009）；中央财政支持地方高校发展专项学科项目（xkc11011）；温州市重点科技创新团队项目（C2012004-02）；浙江省南美白对虾产业技术体系；国家产业技术体系温州综合试验站（CARS-47）；国家贝类产业技术体系浙江综合试验站（CARS-48）；浙江省重大科技专项（2012C12017-3，2012C1300 5）；温州市科技计划项目（2011N0006）；山东省现代农业产业技术体系贝类创新团队项目（SDAIT-19）

*通讯作者