厚朴酚减轻缺血大鼠心肌损伤

宋永辉

(黑龙江省大庆油田总医院 儿科, 黑龙江 大庆 163319)



研究论文

厚朴酚减轻缺血大鼠心肌损伤

宋永辉*

(黑龙江省大庆油田总医院 儿科, 黑龙江 大庆 163319)

目的研究厚朴酚(Mag)对大鼠缺血心肌的保护作用及可能的机制。方法SD大鼠分为对照组、模型组和厚朴酚组。模型组采用结扎大鼠左冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型。Mag组建模型前预先30 min给予高、中和低3种浓度的厚朴酚(40、20和10 mg/kg)。酶联免疫法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活 力 和 丙 二 醛(MDA)含量，DNA 断裂的原位末端标记法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡，Western blot法检测Bcl- 2、caspase- 3和Bax蛋白表达，激光共聚焦技术检测[Ca2+]i。结果1)模型组LVEDP较对照组显著增加(P<0.05)，LVSP及±dp/dtmax较对照组显著降低(P<0.05)。Mag组(40 mg/kg) LVEDP较模型组显著降低(P<0.05)，LVSP及±dp/dtmax较模型组显著增加(P<0.05)。2)模型组Bcl- 2表达较对照组显著降低(P<0.05)，30 mmol/L KCl诱导的[Ca2+]i、Bax及caspase- 3表达较对照组显著升高(P<0.05)。Mag组(40 mg/kg)Bcl- 2表达水平较模型组显著增加(P<0.05)，30 mmol/L KCl诱导的[Ca2+]i、Bax及caspase- 3表达较模型组显著降低(P<0.05)。结论厚朴酚减轻大鼠缺血心肌损伤可能与下调[Ca2+]i和抑制心肌细胞凋亡有关。

厚朴酚; 心肌缺血; Bcl- 2；Bax；caspase- 3

缺血性心脏病亦称冠心病，是发病率高且危害严重的心脏病，心肌缺血后心肌细胞的凋亡与心室重构是导致心功能降低、心力衰竭和恶性心律失常的重要原因。目前，对于心肌缺血导致的心肌损害，仍然缺乏有效的防治措施。厚朴酚(magnolol, Mag)是从中药厚朴(magnoliaofficinalis rehder et. Wilson)中提取的一种含有酚羟基的活性物质。它具有抗炎及抗自由基[1]等药理作用。厚朴酚可减少兔视网膜缺血再灌注神经元凋亡，其机制可能是促进抗凋亡Bcl- 2表达，抑制促凋亡caspase- 3蛋白表达[2]。提示厚朴酚对缺血心肌具有保护作用，其作用机制可能与降低细胞内钙，抑制缺血心肌细胞凋亡相关。本文探讨厚朴酚对缺血大鼠心肌损伤的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级雄性SD大鼠，200～250 g(由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，医动字第0921号)。厚朴酚注射液(纯度98%，南京泽朗生物有限公司)超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所；胶原蛋白酶Ⅱ，牛血清清蛋白(BSA)，HEPES，EGTA(Sigam公司)；Fluo- 3AM(Invitrogen公司)。原位末端标记(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(Roche公司)。Bcl- 2，Bax，甘油醛- 3-磷酸脱氢酶抗体(Cell signaling公司)。

1.2 方法

1.2.1 血流动力学测定：大鼠腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)，麻醉后仰位固定，建立心肌缺血模型[5]。假手术组，穿线不结扎；模型组，结扎左冠状动脉前降支；给药组舌下静脉注射高、中和低剂量(40、20和10 mg/kg)厚朴酚注射液，30 min后结扎左冠状动脉前降支。结扎6 h后，测左心室舒张末期压(left ventricular end dilated pressure，LVEDP)、左心室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室内压上升/下降最大速率(±dp/dt)。

1.2.2 心肌梗死面积的测定：结扎6 h后立即取出心脏，剪下左心室，每隔2 mm将心肌横切成缘片，应用TTC染色检测心肌梗死面积。

1.2.3 血清SOD活力和MDA含量的测定：结扎6 h后经腹主动脉取血，离心制备血清，按试剂盒说明测定SOD活力和MDA含量。

1.2.4 凋亡指数的检测：结扎6 h后，取左心室心肌，10%甲醛固定，常规组织切片，采用原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的d-UTP缺口末端标记法检测心肌细胞凋亡指数，根据凋亡阳性细胞分布情况，在高倍视野(×400)下，每张切片于梗死区周围选择8个无重叠视野，计算细胞凋亡指数。凋亡指数(%)=凋亡阳性的细胞核数/总计数的细胞核数×100%。

1.2.5 Western blot检测：组织匀浆裂解后取心肌总蛋白。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将凝胶电泳分离的蛋白分子转移到硝酸纤维素膜上，然后将膜封闭2 h。用Bcl- 2、Bax 及caspase- 3(1:1 000)的单克隆抗体对膜密闭，于4 ℃冰箱过夜，用1∶5 000稀释的红外荧光标记二抗对膜避光孵育1 h。利用Odyssey红外荧光扫描成像系统对膜上蛋白进行检测，以目的蛋白与内参GAPDH吸度值的比值，表示蛋白的相对水平。

1.2.6 [Ca2+]i的测定：迅速开胸取出麻醉大鼠心脏。心肌细胞分离及染色过程见文献[3]。应用激光扫描共聚焦显微镜，在激发波长为48 8nm，发射波长为530 nm，20×物镜下实时监测[Ca2+]i的变化。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Mag对大鼠血流动力学的影响

模型组LVEDP较对照组显著增加(P<0.05)，LVSP及±dp/dtmax较对照组显著降低(P<0.05)，Mag组(40mg/kg)上述指标变化显著减少(P<0.05)(表 1)。

2.2 Mag对心肌缺血大鼠心肌梗死面积的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死面积明显增大(P<0.05)。Mag(40 mg/kg)组明显回降，但仍高于对照(P<0.05)(表1，图1)。

表1 Mag对急性心肌缺血大鼠血流动力学的影响Table 1 Effect of Mag on hemodynamics in cardiac ischemic rat (n=8)

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with model.

Shown are mean data of infarct size from 10 rats图1 Mag对大鼠心肌梗死面积的影响Fig 1 Effects of Mag on myocardial infarct size of the rats

2.3 Mag对心肌缺血大鼠血清SOD活性和MDA含量的影响

模型组血清SOD活力较对照组明显降低(P<0.05),MDA水平较对照组明显升高(P<0.05)。Mag组(4 0mg/kg)上述指标改变被逆转(P<0.05)(表2)。

表2 Mag对急性缺血大鼠氧化应激的影响Table 2 Effect of Mag on the SODactivity and MDA level in serum of rats(n=8)

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with model.

2.4 Mag对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响

假手术组仅少量心肌细胞凋亡，胞核呈蓝色。模型组大量心肌细胞凋亡，凋亡的心肌细胞核呈棕褐色，Mag组(40 mg/kg)心肌细胞凋亡指数明显降低(P<0.05)(图2)。

2.5 Mag对KCl介导的大鼠心肌细胞 [Ca2+]i升高的影响

心肌缺血细胞与正常大鼠心肌细胞相比[Ca2+]i明显增加， KCl(30 mmol/L)使缺血心肌细胞[Ca2+]i进一步增加(P<0.05)。Mag(100 μmol/L)可以明显降低KCl(30 mmol/L)介导缺血心肌细胞[Ca2+]i升高(P<0.05)(图3)

2.6 Mag对急性心肌缺血大鼠心肌组织Bcl- 2蛋白、Bax蛋白及caspase- 3蛋白表达水平的影响

与假手术组比较，模型组Bax、caspase- 3蛋白水平明显升高(P<0.05)，Bcl- 2蛋白水平降低(P<0.05)。给予Mag(40 mg/kg)后，Bax及caspase- 3蛋白水平显著低于模型组(P<0.05)，Bcl- 2蛋白水平显著高于模型组(P<0.05) (图4，表3)。

3 讨论

氧化应激损伤，是心肌缺血时重要的损伤途径之一。其损伤的程度可通过内源性抗氧化酶SOD活性及MDA水平的变化间接评定。本实验表明，Mag能缩小结扎大鼠心肌梗死范围，提高血清SOD活力，降低MDA水平，提示Mag可抑制脂质过氧化过程，并提高内源性抗氧化酶SOD活性而减轻氧自由基对心肌的损伤。

细胞凋亡是导致缺血性心肌损伤的重要因素。

A,B,C.images of TUNEL staining, D.mean data of positive TUNEL staining from eight rats for each group;*P<0.05 compared with control;#P<0.01 compared with model

图2 Mag对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡指数的影响

Fig 2 Effects of Mag on rat cardiomyocytes apoptosis determined by TUNEL staining(×40)

A.cardiomyocytes；B.ischamic cardiomyocytes; C.ischamic cardiomyocytes+KCl；D.ischamic cardiomyocytes+KCl+Mag(×40);*P<0.05 compared with normal cardiomyocytes;#P<0.05 compared with ischamic cardiomyocytes;△P<0.05 compared with ischamic cardiomyocytes incubated with KCl

图3 Mag对KCl介导的急性心肌缺血大鼠心肌细胞[Ca2+]i的影响Fig 3 Effect of Mag on [Ca2+]i elevation induced by KCl of rat cardiomyocytes in Tyrode solution (n=5) 表3 Mag对急性心肌缺血大鼠Bcl- 2、Bax及caspase- 3蛋白表达的影响Table 3 Effects of Mag on the expression of Bcl- 2, Bax and caspase- 3 protein in rats(n=8)

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with model.

图4 Mag对急性心肌缺血大鼠Bcl- 2、Bax及caspase- 3蛋白表达的影响Fig 4 Effect of Mag on the express of Bcl- 2, Bax and caspase- 3 protein in rats

细胞凋亡的发生与Bcl- 2/Bax这一对凋亡调控基因的表达水平密切相关[4]。Caspases是白介素1 转化酶样蛋白酶。家族某一成员的激活都会将caspases激活，最终引起细胞凋亡，故有人将caspases称为细胞凋亡的执行者[5]。本研究表明，缺血6 h后，在模型组梗死心肌周围出现了凋亡的心肌细胞，心肌细胞凋亡指数较假手术组明显增加，而Mag对心肌缺血所诱发的心肌细胞凋亡具有明显的抑制作用，能明显降低心肌细胞凋亡指数。Mag还能使缺血心肌的Bcl- 2表达明显增加，Bax及caspase- 3表达明显降低。提示Mag对缺血心肌的保护作用可能部分是通过减少心肌细胞凋亡来实现的。

在心肌缺血过程中，细胞内[Ca2+]i超载是引起心肌细胞损伤的重要机制之一。本文显示，Mag可以降低心肌细胞[Ca2+]i，说明其心肌保护作用可能与减少心肌缺血时的细胞内钙超载有关。

综上所述，Mag对大鼠缺血心肌具有保护作用，其机制可能与下调心肌细胞[Ca2+]i，抑制心肌细胞凋亡有关。

[1] Kiiicogiu B，Erogiu E，Kiiicogiu SS，etal. Effect of abdominai trauma on hemorrhagic shock-induced acute iunginjuryinrats[J]. World J Gastroenterol，2006,12:3593- 3596.

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[4] Tokar T, Ulicny J. The mathematical model of the Bcl- 2 family mediated MOMP regulation can perform a non-trivial pattern recognition[J]. PLoS One,2013, 8:e81861. doi: 10.1371/journal.pone.0081861.

[5] Zhang Y, Yuan F, Cao Xetal.P2X7 receptor blockade protects against cisplatin-induced nephrotoxicity in mice by decreasing the activities of inflammasome components, oxidative stress and caspase- 3[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2014, 281:1- 10. doi: 10.1016/j.taap.2014.09.016

Magnolol relieves ischemic myocardial injuries of rats

SONG Yong-hui*

(Dept. of Pediatrics, Heilongjiang Daqing Oil Field General Hospital, Daqing 163319, China)

Objective To explore the possible role of magnolol in myocardial ischemic damage and potential signaling pathways as potential mechanisms. Methods The protective properties of magnolol were studied in rat model of acute myocardial infarction due to permanent ligation of the left anterior descending coronary artery. MDA content and SOD activity was measured by ELISA method. Apoptosis of cardiomyocytes was also observed by TUNEL staining.The expression of Bcl- 2, Bax and caspase- 3 were examined by Western blot.Intracellular calcium concentration [Ca2+]iwas tested Laser scanning confocal microscopy. Results Administration of magnolol relieved myocardial injuries during ischemia, and this were achieved by protecting cardiomyocytes from apoptotic death. The beneficial effects of magnolol were likely mediated by activation of the survival signaling molecule (Bcl- 2), and a reduction of apoptotic mediator (Bax, caspase- 3) and intracellular Ca2+overload. Conclusions Administration of magnolol relieved myocardial injuries during ischemia, and this is achieved by protecting cardiomyocytes from apoptotic death.

magnolol; myocardial ischemic; Bcl- 2；Bax；caspase- 3

2014- 06- 30

2015- 01- 09

1001-6325(2015)04-0518-05

R542.2+2

A

*通信作者(corresponding author)：565339199@qq.com