PRAS40活性调节与功能的研究进展

朱燕婷，赵 迪，史道华

(福建省妇幼保健院 药剂科， 福建 福州 350000)



短篇综述

PRAS40活性调节与功能的研究进展

朱燕婷，赵 迪，史道华*

(福建省妇幼保健院 药剂科， 福建 福州 350000)

PRAS40是蛋白激酶B(PKB/ Akt)的作用底物，亦是mTORC1的特异性结合蛋白，有多个位点可发生磷酸化，其中Thr246磷酸化受Akt调控，而Ser183、Ser212及Ser221等磷酸化主要受mTORC1调控。磷酸化修饰的PRAS40可调节与Raptor及14- 3- 3等蛋白的结合，参与Akt、mTORC1活性的调控。PRAS40具有调控细胞增殖、参与神经损伤保护等作用，在胰岛素抵抗、神经退行性病变及肿瘤中扮演重要角色，有望成为药物作用的新靶点。

PRAS40；磷酸化修饰；胰岛素抵抗；神经退行性病变；癌症

PKB/ Akt是PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)信号通路的重要效应蛋白，在细胞增殖、分化、凋亡及葡萄糖代谢等基本生命过程中发挥关键的调节作用。PRAS40(proline-rich Akt substrate of 40 kDa)是近年发现的相对分子质量为40 ku的PKB/Akt新作用底物，其氨基末端含多个脯氨酸富集的结构域。PRAS40在不同状态的细胞中表达量和磷酸化活性不尽相同，而不同细胞中的PRAS40对PI3K信号的应答也不一，可作为肿瘤早期诊断的指标。PRAS40为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of Rapamycin complex 1, mTORC1)的特异性组成蛋白之一，不仅可与mTORC1另一特异性组成蛋白Raptor(regulatory associated protein of mTOR)相互作用，还可直接结合mTOR激酶域，从而调控mTORC1的活性[1]。近期研究还证实该蛋白中含富集亮氨酸的核输出信号(nuclear export signal, NES)，且其在细胞核内聚集可抑制胰岛素的活性[2]。PRAS40可在细胞质和细胞核间转移，其中，PRAS40-Thr246主要定位于细胞核内，与Akt的调控有关[3]。

1 PRAS40的蛋白结合

1.1 结合Raptor

PRAS40与Raptor可直接结合，并通过内源性多肽发生相互作用，无需mTOR参与，但受氨基酸水平的调节。PRAS40与Raptor的结合需要完整的mTOR信号模体(mTOR signaling motif, TOS)及该蛋白第150-234之间的氨基酸序列包括Ser183位点。PRAS40通过TOS样模体竞争性结合Raptor底物作用位点，下调mTORC1的活性表达，同时抑制mTORC1下游底物的磷酸化；当机体氨基酸或胰岛素水平升高时，二者解离，mTORC1恢复活性。

1.2 结合14- 3- 3蛋白

氨基酸充足时，PRAS40磷酸化并结合14- 3- 3蛋白，进而激活Akt、诱发一系列生物学效应，该作用可被雷帕霉素抑制。二者结合有赖于Ser221及Thr246位点的磷酸化，而Phe129、Ser183或Pro185等位点的突变不仅可减弱二者结合的亲和力，还可降低PRAS40的整体磷酸化水平。有趣的是，Ser183位点的磷酸化还可抑制Thr246位点的去磷酸化，可见Ser183位点的磷酸化是PRAS40得以结合14- 3- 3的关键[4]。前期研究普遍认为，PRAS40多个位点如Ser183、Ser221或Thr246等突变导致的PRAS40与14- 3- 3蛋白结合减少，可减弱其对mTORC1的抑制作用，但仍需进一步证实[5]。

2 PRAS40活性调节

2.1 Akt调节

PRAS40多个位点可发生磷酸化，目前研究较多的有Ser183、Ser202、Ser203、Ser212、Ser221及Thr246等[6]。其中，PRAS40-Thr246的磷酸化主要受PKB/Akt的调控，且该位点的磷酸化可促进mTORC1诱导的PRAS40-Ser183磷酸化的发生[4]。PI3K-Akt的活性受胰岛素、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)等信号分子的调控，激活后可使磷酸肌醇依赖性激酶1(PDK- 1)、Akt-Thr308等磷酸化，最终诱导PRAS40-Thr246磷酸化及与14- 3- 3蛋白结合(图1)。PI3K抑制剂或敲除Akt1/2均可降低PRAS40-Thr246磷酸化水平[7]。敲除mTORC2特异性结合蛋白Rictor(rapamycin-insensitive companion of mTOR)后，该位点磷酸化水平显著下降[8]。雷帕霉素(主要抑制mTORC1活性，延长处理时间亦可抑制mTORC2活性)可部分抑制PRAS40在Thr246磷酸化水平。此外，研究发现多种细胞中该位点的磷酸化可不依赖PKB/Akt，如在心脏组织中，亮氨酸诱导的该位点磷酸化只需要PDK1-PI3K的参与；小鼠骨髓FDCP1细胞的PRAS40-Thr246位点磷酸化受原癌基因编码蛋白激酶PIMI调控；而甲状腺细胞中该位点的磷酸化被证实与蛋白激酶A对甲状腺激素及cAMP的应答有关[9- 11]。

2.2 mTORC1调节

体内、外研究证实mTORC1对PRAS40的磷酸化位点主要位于羧基末端，包括PRAS40-Ser183、Ser212、Ser221、Ser202、Ser203及Thr246等位点。在Ser212、Ser221位点突变的细胞系中，PRAS40受mTORC1磷酸化减少；继续突变Ser183，则mTORC1介导的PRAS40磷酸化水平几乎被抑制；用雷帕霉素和FKBP12同时处理细胞后，以上3个位点的磷酸化水平也显著降低，可见是mTORC1磷酸化PRAS40的主要位点。此外，胰岛素虽可使Ser202、Ser203、Ser212及Ser221等位点发生磷酸化，但体内研究显示，只有Ser221位点的磷酸化对雷帕霉素敏感，因此，Ser202、Ser203、Ser212位点的磷酸化可能还受mTORC1以外的蛋白激酶调控[1]。PRAS40的磷酸化尤其是Ser221、Ser183位点的磷酸化是其调控mTORC1活性的关键，当Ser221或Ser183位点突变为Ala时，PRAS40与14- 3- 3的结合减少，对mTORC1的抑制作用增强[12]。

mTORC1介导PRAS40磷酸化与mTOR和Raptor之间的结合无关，PRAS40通过TOS样模体与mTORC1的结合，其抑制mTORC1活性的主要机制为：1)与mTORC1下游磷酸化底物竞争性结合mTORC1位点，抑制mTORC1对转录调节子4EBP1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1)及蛋白S6激酶(S6K1)等效应蛋白的磷酸化；2)与4EBP1竞争性地结合mTORC1，抑制Ras家族G蛋白Rheb对mTORC1的活化，间接地负调控mTORC1活性[13]。干扰PRAS40可增加AMPK(AMP-activated protein kinase)对Raptor的磷酸化，促进mTORC1的活性表达。然PRAS40缺失亦被发现可增强AMPK介导的mTOR负调节子TSC2(Tuberous Sclerosis Complex 2)的磷酸化水平，部分抑制mTORC1的活性，显示PRAS40的正调控作用[14]；且PRAS40为mTORC1正调节子Rheb等发挥作用所必须，但其作用机制需进一步阐明。近期一项果蝇实验证明，PRAS40对mTORC1的正、负调节作用取决于该蛋白的翻译后修饰，且具有组织特异性[15]。

图1 Akt/mTORC1对PRAS40活性的调节Fig 1 Regulation of PRAS40 throught Akt and mTORC1

3 PRAS40的功能

3.1 调控细胞生长

PRAS40最重要的生理作用之一是负调控mTORC1活性，参与蛋白合成、细胞核转运以及酶活性等生理过程，与细胞增殖密切相关。PRAS40磷酸化后从mTORC1中解离，对mTORC1的抑制作用减弱；而两者重新结合不仅可抑制mTORC1的自我磷酸化，还可下调mTORC1诱导的4EBP1和S6K1的磷酸化。PRAS40还可抑制细胞凋亡，与肿瘤坏死因子TNF 或环十二碳三烯诱导的细胞凋亡密切相关。另外，干扰PRAS40不影响成肌细胞C2C12的凋亡水平，但可使细胞生长停滞在G1期，细胞增殖率降低[16]。

绝大多数的肿瘤细胞中可见PTEN-PI3K-Akt及mTOR信号通路活性的增高，且在恶性黑色素瘤细胞中，PRAS40-Thr246磷酸化水平与Akt活性平行增高，分别抑制两者均可诱导黑色素瘤细胞凋亡[17- 18]。但PRAS40磷酸化水平只受Akt3调控，与Akt1/2表达水平无关，而Akt3选择性抑制剂难以研发，故靶向PRAS40的药物可成为治疗恶性肿瘤的新选择[19]。此外，在未分化脑膜瘤中亦发现PI3K-PRAS40-Akt-mTOR信号通路的异常活化，mTORC1在脑膜瘤和神经鞘瘤的生长中起重要的调节作用，而PRAS40作为mTORC1下游重要的负调节蛋白， PRAS40-Thr246已成为PI3K-PRAS40-Akt及mTOR通路抑制剂治疗肿瘤的疗效评价指标[20]。

3.2 参与神经损伤的保护作用

PRAS40可调控细胞存活及凋亡，参与NGF受体TrKA介导的局部缺血状态下的神经损伤保护。短暂局灶性脑缺血后，NGF可激活Akt、促使p-PRAS40表达及其与14- 3- 3蛋白的结合，抑制运动神经元细胞凋亡；过表达PRAS40可降低神经元细胞凋亡坏死、局灶性脑缺血及脊椎损伤的发生率[21]。另外，因雷帕霉素无法模拟PRAS40沉默引起的促凋亡作用，故推测PRAS40抑制凋亡的作用可能与mTORC1无关，需深入研究。

β-淀粉样蛋白(Aβ)堆积产生的毒性是神经退行性病变的重要原因，可引起Wnt1诱导的信号通路蛋白1(WISP1)表达上调。WISP1通过磷酸化PRAS40及调控其与14- 3- 3的结合可活化mTORC1，并诱导S6K1及4EBP1磷酸化；敲除PRAS40或WISP1抑制PRAS40表达，具有保护细胞的作用[20]。另外，mTORC1可通过调节细胞自噬及坏死性凋亡，干预阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的发病进程，故靶向WISP1、mTOR信号通路分子包括PRAS40有望为AD等疾病的治疗带来福音[22]。

3.3 调控糖代谢

体内研究证实，2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗(Insulin Resistance，IR)的发生与PRAS40-Thr246位点磷酸化异常相关，该位点磷酸化水平及其与14- 3- 3蛋白的相互作用是胰岛素激活mTOR的关键，是胰岛素敏感性的重要调节子，可能成为治疗IR的潜在作用靶点[23]。PRAS40沉默可增加S6K1基础磷酸化水平，导致胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1，IRS1)降解，从而减弱胰岛素对S6K1的磷酸化能力，抑制胰岛素介导的Akt信号通路对葡萄糖转运蛋白GLUT- 4摄取葡萄糖的调节，呈现IR[24]，而此时增加mTOR的基础催化酶活性，可负反馈抑制胰岛素诱导的mTOR活性[4]。目前尚不知mTORC1的活化与胰岛素介导的PRAS40-Thr246磷酸化是否有直接关系，而PRAS40-Thr246磷酸化的发生是否为mTORC1高度活化的结果也需证实。此外，IR小鼠骨骼肌细胞mTORC1高度表达，但雷帕霉素不能完全改善其IR状态，由此可见mTORC1外的其他因素也参与了IR的调控。深入探究胰岛素介导的PRAS40磷酸化水平与mTORC1信号通路之间的关系，有望进一步阐明IR病理机制，为IR治疗提供新方向。

高糖可使肾小球系膜细胞肥大，最终导致糖尿病肾病的发生。糖尿病大鼠肾细胞肥大，已证实与PRAS40磷酸化水平的增高密切相关。高糖环境可活化Akt，诱导肾小球系膜细胞PRAS40磷酸化，导致抑癌基因PTEN(phosphatase and tensin homologue)表达下降，而促癌基因DJ- 1表达增加，最终促使肾小球系膜细胞病理性肥大。沉默PRAS40可模拟高糖环境对肾小球系膜细胞的效应，提示由葡萄糖介导的PRAS40磷酸化失活可能参与糖尿病患者肾细胞的病理性改变[25]。

4 展望

PRAS40磷酸化位点的调控及其介导mTORC1在细胞增殖的作用渐为人知，但需探究的问题亦较多，如PRAS40脯氨酸富集结构域在激活mTORC1及调节PRAS40结合其他蛋白的作用；PRAS40细胞核内定位对其活性及细胞增殖的影响；PRAS40从mTORC1解离后mTOR调控PRAS40磷酸化的方式；PRAS40正调控mTORC1的分子机制等。总之，深入了解PRAS40的功能及调节机制，有助于揭示肿瘤等多种疾病的发病机制，为相关药物研发提供新的作用靶点，并为临床提供有效的诊疗策略。

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住机场附近的人易患脑卒中及心脏病

据英国《BBC新闻》(BBC NEWS)2013年10月9日报道，根据英国伦敦帝国学院公布的一份最新研究报告，居住在邻近机场的居民长时间暴露在高分贝噪音下，不仅容易患脑卒中，同时罹患心血管疾病的概率也较高。

伦敦帝国学院(Imperial College London)研究人员根据英国民航局的噪音标准规定，对伦敦市中心及邻近希斯罗机场的12个地方区域，以及9个伦敦附近的城市，包括温莎、美登赫(Maidenhead)、史劳(Slough)及乌金罕(Wokingham)等地进行调查。这些地区的飞机噪音超过50分贝(约是在安静的室内一般人交谈音量)，有些民众甚至必须忍受63分贝以上的噪音。研究人员同时将吸烟和脑卒中与心脏疾病相关的因素考虑在内。

调查发现，360万名住在希斯罗机场附近的居民，脑卒中及罹患心血管疾病的概率高出其他地区10%～20%，住在噪音最严重地区的7万名居民，不论因脑卒中、心血管疾病住院及死亡的风险也较高。

带领这项研究的韩瑟尔博士(Dr. Anna Hansell)指出，虽然无法断言噪音是造成居民生病的主要原因，但是噪音的确不利健康，例如高分贝的噪音会造成血压升高或影响睡眠，从而影响健康。

研究人员强调，固然飞机噪音导致居民患病概率升高，但吸烟、缺乏运动及不良饮食对健康的伤害更大。

这篇研究报告刊登在《英国医学期刊》(British Medical Journal)。

Research progress in regulation of the activities and functions of PRAS40

ZHU Yan-ting, ZHAO Di, SHI Dao-hua*

(Dept. of Pharmacy, Fujian Provincial Maternal and Child Health Hospital, Fuzhou 350000, China)

PRAS40, a substrate of protein kinase B (PKB/Akt), is a specific binding protein of mTORC1. There are several conservative phosphorylation sites in PRAS40 including Thr246induced by Akt and Ser183, Ser212and Ser221regulated by mTORC1. When phosphorylated, PRAS40 interacts with Raptor or 14- 3- 3 protein and participates in regulating the activity of Akt and mTORC1. PRAS40 also plays an important role in insulin resistance, neurodegenerative disorders and cancer owing to its function in regulating cell growth and neuroprotective effects. As a result, PRAS40 may be a promising drug target.

PRAS40; phosphorylation; insulin resistance; neurodegenerative disorders; cancer

2014- 10- 15

2014- 12- 26

福建省自然科学基金(2012J01312)；福建省医学创新课题(2012-CXB- 11)

1001-6325(2015)04-0536-05

R34

A

*通信作者(corresponding author)：shidh@yeah.net