重组kisspeptin- 10抑制子痫前期患者HUVECs的体外增殖、迁移及血管形成

李 末，凌 燕，任 敏，况海斌，杨 蓓*

(1.南昌大学 基础医学院 生理学教研室, 江西 南昌 330006； 2.江西省人民医院 妇产科， 江西 南昌 330006)



重组kisspeptin- 10抑制子痫前期患者HUVECs的体外增殖、迁移及血管形成

李 末1，凌 燕2，任 敏1，况海斌1，杨 蓓1*

(1.南昌大学 基础医学院 生理学教研室, 江西 南昌 330006； 2.江西省人民医院 妇产科， 江西 南昌 330006)

子痫前期患者主要特征是胎盘血管形成异常，其血清及胎盘中kisspeptin表达水平明显上升[1]，其受体GPR54表达于冠状动脉，且kisspeptin- 10可促进冠状动脉收缩[2]，故推测，kisspeptin/GPR54系统可能参与子痫前期异常血管的形成与发展。本研究应用体外培养人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)，观察kisspeptin- 10对子痫前期患者HUVECs增殖、迁移及血管形成的影响，揭示其在子痫前期发病中作用。

1 材料与方法

1.1 材料：脐带取自江西省人民医院妇产科，且获该单位伦理委员会的批准及患者知情同意；GPR54 抗体(Novus公司)；重组Kisspeptin- 10(Phoenix公司)，MTS试剂盒(Promega公司)。

1.2 方法：1)常规分离与培养HUVECs。2)免疫荧光染色：细胞经甲醇和丙酮固定，后加入兔抗人GPR54 抗体，再用抗兔FITC标记的二抗，碘化丙啶(PI)染核，在激光共聚焦显微镜下观察荧光信号。3)细胞增殖：采用MTS法。实验分为5组(每组n=4)：①对照组；②～④组浓度分别为1、100 nmo/L和1 μmol/L重组Kisspeptin- 10；⑤10%胎牛血清组(10%FCS)。

4)划痕和管状结构形成实验：实验分为3组(每组n=4)：①对照组；②子痫前期患者组； ③1 μmol/L Kisspeptin- 10干预组。10% FCS培养48 h时后，采用尼康 TS2100 采集图片，用ImageJ软件计算细胞迁移距离和管状结构的面积。每组实验重复3次。

2 结果

2.1 GPR54 受体在HUVECs的表达：GPR54 受体蛋白表达于HUVECs(图 1)。

2.2 Kisspeptin- 10对HUVECs增殖的影响：kisspeptin- 10浓度为 100 nmol/L 和1 μmol/L时，可明显抑制HUVECs增殖(P<0.05，P<0.01)；10% 胎牛血清明显增加HUVECs增殖(P<0.01)(图 2)。

2.3 Kisspeptin- 10明显降低HUVECs迁移：1 μmol/L kisspeptin- 10组，HUVECs迁移率为75.2%±9.6%，显著低于对照组的100.0%±10.1%(P<0.01)，而 10% FCS组为130.5%±18.3%，显著高于对照组(P<0.01)。

A.FITC; B.PI; C.Merge

*P<0.05，**P<0.01 compared to control图2 MTS分析kisspeptin- 10对HUVECs增殖的影响Fig 2 Effect of kisspeptin- 10 on the proliferation of HUVECs by MTS analysis

2.4 Kisspeptin- 10对HUVECs管形形成的影响：1 μmol/L kisspeptin- 10组，HUVECs管形的形成相对面积为78.1±9.1，显著低于对照组的100.0±10.2(P<0.01)，而 10% FCS组为120.3±12.8，显著高于对照组(P<0.01)。

3 讨论

在黑色素瘤中,有一个新的cDNA片段，命名为Kiss1，它主要表达于胎盘和大脑。在合成过程中，Kiss1首先形成一个含145个氨基酸的前体，经过相关酶的裂解形成含有54、14、13和10个氨基酸残基产物，分别称为kisspeptin-54、kisspeptin-14、kisspeptin-13和kisspeptin-10，统称为kisspeptins[2]。kisspeptin- 10与受体GPR54亲和力最高,作用最强，故本研究选择kisspeptin- 10来观察其对血管形成的影响。为了明确子痫前期患者血清kisspeptins水平升高对血管形成的影响，笔者首先观察了其受体GPR54是否表达于HUVECs。结果显示，GPR54受体表达于HUVECs，提示该系统可能参与了子痫前期疾病的发生。

在子痫前期患者中，其主要病理特征是胎盘血管形成异常。本结果显示，重组kisspeptin- 10可明显抑制HUVECs增殖、迁移以及血管管形的形成。已有报道，子痫前期患者血清及胎盘中kisspeptin表达水平明显上升[1]，这可能是导致子痫前期患者胎盘血管的形成障碍原因之一。kisspeptin- 10还可通过抑制基质金属蛋白酶2和9的分泌，导致滋养层细胞的侵入不足。而血管重构障碍及滋养层细胞侵入不足，正是子痫前期患者的主要特征。子痫前期患者另一个主要症状是血压明显升高，kisspeptin及其受体GPR54表达于冠状动脉的血管平滑肌，且重组kisspeptin- 10可促进冠状动脉收缩[2]。青春期间人体血压增长的速率明显高于青春期前、后，而在青春期间血液中kisspeptins表达水平明显升高，升高的kisspeptins也可能通过促进血管的收缩，导致子痫前期患者血压的升高。

综上所述, kisspeptin/GPR54系统可能参与子痫前期患者异常血管和血压的形成与发展。

[1] Qiao C, Wang C, Zhao J,etal. Elevated expression of KiSS- 1 in placenta of Chinese women with early-onset preeclampsia [J]. PLoS One, 2012, 7:1- 9.

[2] Mead EJ, Maguire JJ, Kuc RE,etal. Kisspeptins are novel potent vasoconstrictors in humans, with a discrete localization of their receptor, G protein-coupled receptor 54, to atherosclerosis-prone vessels[J]. Endocrinology, 2007,148:140- 147.

2014- 06- 25

2014- 12- 01

国家自然科学基金(81270668，30960118)；江西省“赣鄱英才555工程”(1800066)

1001-6325(2015)04-0526-02

R714

A

*通信作者(corresponding author)：yangbei@ncu.edu.cn