重组H9N2禽流感病毒的构建及其在不同细胞中的复制特性

贾倩楠，赵丽丽，邓 涛，曹萌萌

(中国医学科学院 北京协和医学院 病原生物学研究所， 北京 100176)



研究论文

重组H9N2禽流感病毒的构建及其在不同细胞中的复制特性

贾倩楠，赵丽丽，邓 涛，曹萌萌*

(中国医学科学院 北京协和医学院 病原生物学研究所， 北京 100176)

目的利用反向遗传学技术构建具有感染性的H9N2亚型禽流感病毒，并揭示其在不同细胞中的复制特性。方法以A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)禽流感病毒基因组RNA为模板，用RT-PCR技术获得该病毒的8条完整基因片段，并分别将它们插入到pHW2000载体上，最终在293T细胞中包装产生重组H9N2病毒。并将重组的H9N2病毒感染不同细胞，观察病毒在不同细胞上的增殖状况来揭示该病毒在不同细胞上的复制特性。结果应用流感病毒8质粒反向遗传学技术，成功获得重组病毒，并揭示了该毒株在不同细胞(A549, MDCK, Vero)中的复制特性,发现A549人肺腺癌细胞更适宜H9N2病毒的正常复制。此外还分析总结了该毒株的与病毒毒力相关的重要位点特征。结论成功建立了H9N2禽流感病毒的反向遗传系统，该系统的建立为在分子水平研究H9N2病毒以及制备H9N2禽流感疫苗提供了依据。

禽流感病毒；反向遗传学；复制特性

近年来，流感病毒的传播呈现出新的趋势，如高致病性毒株不断出现、禽流感病毒突破宿主间屏障进行跨种间传播[1]等。1998年H9N2禽流感病毒在广东出现全球首例人感染H9N2病毒的病例，随后在香港和内地也出现人感染H9N2病毒的病例。这说明H9N2病毒已经突破宿主间屏障，能够直接感染人类。有血清学调查显示，H9N2病毒对人源唾液酸受体的亲和力，比H5N1更强[2]。还有研究发现，H9N2病毒的HA和NA与2009年世界大流行的H1N1病毒6个基因重组的病毒能显著提高病毒的致病力和适应性[3]。如果H9N2病毒发生变异，获得更高的致病力和人与人直接传播的能力，极有可能导致下一次流感大流行。因此，对H9N2禽流感病毒的研究和监测具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 主要材料

A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)(中国科学院生物物理研究所李春峰博士馈赠)。pGL3-IFNβ-Luc和pGL3-RLuc质粒(赵振东教授馈赠)。RNA提取试剂Trizol、反转录试剂SuperScriptⅢ和转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)。T4 DNA连接酶和BsmBⅠ限制性内切酶(New England BioLabs公司)。锥虫蓝染液Trypan Blue Dye(BIO-RAD公司)。荧光素酶检测试剂盒Dual-Luciferase Reporter Assay System和MTT试剂(Promega公司)。

1.2 引物设计与合成

根据病毒序列设计反转录通用引物5′-AGC AAAAGCAGG-3′。同时设计PCR扩增引物，在引物5′加入BsmBⅠ酶切位点(表1)。

表1 H9N2病毒各基因引物序列Table 1 Primer sequences of eight genes of A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)

1.3 重组质粒的构建

按照相应试剂说明书提取病毒RNA，进行RT-PCR扩增。PCR产物及pHW2000经酶切连接后，转化并挑取阳性克隆测序，得到8个重组质粒。

1.4 细胞转染和病毒拯救

将8个重组质粒转染到MDCK和293T细胞中，当有明显的细胞病变时收集上清，即为所需的病毒，经两次传代培养后作为病毒储存液。

1.5 噬斑计数实验和病毒增殖曲线绘制

将病毒逐次10倍稀释，分别感染MDCK细胞，37 ℃孵育72 h，计数可见噬斑的数量，并计算病毒滴度。将病毒以MOI=0.001感染细胞，分别收取12～108 h的细胞上清，根据不同时间的病毒滴度绘制病毒的增殖曲线。

1.6 锥虫蓝染色实验

将病毒以MOI=0.1感染细胞，待感染的细胞出现明显病变后，加入0.04%锥虫蓝染液，3 min后观察细胞活性变化。

1.7 MTT实验

将H9N2病毒分别以MOI=1、2、4感染A549细胞，按参考文献[4]的实验步骤，于490 nm波长处测量吸光度。

1.8 细胞干扰素表达活性检测

将pGL3-IFNβ-Luc和 pGL3-RLuc质粒转染到细胞中，24 h后将病毒以MOI=1感染细胞。24 h后裂解细胞，检测荧光素酶。

图1 H9N2禽流感病毒RNA的RT-PCR产物电泳图Fig 1 RT-PCR products of genes from avian influenza virus A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)

2 结果

2.1 重组质粒的构建与鉴定

H9N2病毒RNA的RT-PCR产物(图1)，并对8个重组质粒测序，各片段序列与原始毒株完全一致。

2.2 重组病毒的拯救

细胞转染(图2)后，细胞病变情况(图3)。同时对病毒进行全基因组测序，测序结果与原始毒株的序列完全一致。

图2 8质粒操作系统拯救病毒流程图Fig 2 Eight-plasmid system for generation of A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)

A.cytopathic effect; B.negative control图3 细胞转染后细胞病变结果Fig 3 Cytopathic effect after cell transfection(×100)

2.3 病毒复制能力的比较

重组病毒与野生型病毒在MDCK细胞上的增殖几乎一致，编码H9N2的8个重组质粒被成功构建，得到H9N2亚型流感病毒(图4)。

图4 病毒在MDCK细胞上的增殖曲线Fig 4 Growth curves of the viruses in MDCK cells

2.4 病毒对细胞功能的影响

H9N2病毒能对细胞造成损伤(图5A,B)，可以诱导细胞死亡并呈现剂量依赖现象(图5C)。感染H9N2病毒的细胞干扰素表达量是正常细胞表达量的17.58倍，H9N2病毒能够诱导细胞表达更高水平的干扰素。

2.5 病毒在不同细胞复制能力的比较

H9N2病毒在A549上增殖最快；在MDCK上增殖较慢，滴度较A549细胞低；在Vero上增殖过程与MDCK相似，但病毒滴度比MDCK上高(图6)。

2.6 A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)毒力相关的重要位点分析

该病毒的PB2上与毒力相关的位点呈现低毒力特征， 而在PA上则多呈现高的复制活性。此外还对决定宿主特异性的关键位点进行了分析，表现为PB2 627E/701D，提示了H9N2的跨种传播并不依赖于上述两个位点的改变(表2)。

A.trypan blue dye after cell infection; B.negative control; C.MTT assay

图6 病毒在不同细胞上的增殖曲线Fig 6 Growth curves of the viruses in different cells

3 讨论

2013年爆发的H7N9病毒6个内部基因来源于两个不同组的H9N2病毒[11]。而H7N9本是感染野生鸟类的禽流感病毒，在家禽中几乎无法生存并传播，而H7N9和H9N2的基因重组可能就是H7N9在禽类中传播的原因，也可能由此演变成能感染人类的病毒[12]。因此，H9N2禽流感病毒对人类健康造成严重威胁，迫切需要全球的共同监测及预防。

本研究发现H9N2病毒在3种不同细胞中都能正常增殖，提示了H9N2病毒具有跨种传播的潜质。同时该病毒在A549细胞上的复制速度远高于MDCK和Vero细胞，这提示人肺腺癌细胞更适合H9N2病毒增殖。此外，该病毒在Vero细胞上的整体病毒滴度较MDCK高，由于Vero细胞上缺乏INF受体，不能激活INF信号通路，因此更利于流感病毒的复制。

通过流感病毒反向遗传学研究，发现禽流感病毒PB2 627位点与病毒的复制能力和宿主特异性有密切的关系，E627K突变不仅提高病毒的复制能力，而且增强了病毒对小鼠的致病力，揭示了H5N1对人类致病的分子机制，而通过分析看到，H9N2的627位氨基酸仍为E，为禽类流感病毒特有的，但该病毒在哺乳动物细胞上增殖状态良好，提示了该H9N2病毒在跨种传播上不依赖于PB2 627位点的突变。PB2 627E/701N可能是PB2 627K在增强哺乳动物感染可能性上的补充[5]，由此推测，H9N2病毒能够感染哺乳动物很可能存在新的潜在决定位点。

表2 A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)毒力相关的分子标记Table 2 Molecular virulence markers of A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)

由于H9N2病毒可以跨种传播，且致病力比H5N1弱，因此可作为研究跨种传播机制的模式病毒。H9N2病毒反向遗传学技术的建立，不仅可以研究禽流感病毒跨种属传播人类的机制，对禽流感病毒的重组和进化进行有效监控；还可以对病毒基因组进行修饰改造，研究与减毒及温度敏感表现型有关的序列，鉴定得到优质高效的疫苗株，为H9N2病毒新型疫苗的研制开辟新途径；同时通过结合点突变技术，在病毒复制能力、致病性和宿主适应性的研究上发挥了关键作用。

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Generation of an H9N2 avian influenza virus and characterization of its replication properties in different cells

JIA Qian-nan, ZHAO Li-li, DENG Tao, CAO Meng-meng*

(Institute of Pathogen Biology，CAMS & PUMC，Beijing 100176，China)

Objective Generation of an H9N2 avian influenza virus with reverse genetics and characterization of its replication properties in different cells. Methods Eight gene segments of avian influenza virus A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2) were amplified by RT-PCR technique and inserted into the pHW2000 vectors. The recombinant virus was rescued by cell transfection and the virus replication properties were analyzed in A549, MDCK and Vero cells. Results Using eight plasmid-based reverse genetics, the recombinant Avian H9N2 influenza virus was rescued. It was observed that A549 cells were more suitable for the H9N2 virus replication than MDCK cells and Vero cells. The molecular virulence markers of the virus were also summarized with bioinformatics technology. Conclusions The eight plasmid-based reverse genetic system successfully set up the avian H9N2 virus. The system may not only facilitate genetic manipulation of the H9N2 virus but also provide a platform in studying the virus and developing avian influenza vaccine.

avian influenza virus; reverse genetics; replication property

2014- 12- 19

2015- 01- 13

病毒性疾病感染组学关键技术平台十二五重大专项(2013ZX10004601-002)

1001-6325(2015)04-0480-05

R373.1+3

A

*通信作者(corresponding author)：caommeng@ipbcams.ac.cn