免疫去除血清高丰度蛋白对组织蛋白质组鉴定的影响

邹丽莉，李文婷，王丹琪，王 曌，孙 伟*

(1.中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 中心实验室， 北京 100005 2.中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 人体解剖与组织胚胎学系， 北京 100005)



研究论文

免疫去除血清高丰度蛋白对组织蛋白质组鉴定的影响

邹丽莉1，李文婷2，王丹琪1，王 曌1，孙 伟1*

(1.中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 中心实验室， 北京 100005 2.中国医学科学院 基础医学研究所 北京协和医学院 基础学院 人体解剖与组织胚胎学系， 北京 100005)

目的分析去除组织中血清高丰度蛋白对组织蛋白质组鉴定的影响。方法用去除12种血清高丰度蛋白抗体柱处理人甲状腺和垂体组织样品，所得到的低丰度蛋白和原样分别进行液质联用分析，分别进行多肽和蛋白质水平的定性定量分析。结果甲状腺和垂体组织中血清高丰度蛋白分别被除去了92.11%±12.87%和78%±25%。所鉴定到的多肽和蛋白与原样品相比，甲状腺组织的非冗余性多肽提高了70%、蛋白数目提高了16.5%，垂体的非冗余性多肽提高了21.9%，鉴定蛋白数目无明显变化。结论去除组织中的血清高丰度蛋白法可以显著的提高肽段和蛋白的鉴定效率，更适用于血管密集的样品。

甲状腺蛋白质组; 垂体蛋白质组; 去除血清高丰度蛋白; 液质联用分析

随着蛋白质组学技术的不断发展，组织样品被越来越广泛的用于相关疾病的生物标志物研究[1- 2]。但有些组织样品周围或内部血管分布比较密集，组织取样时容易受到血液污染。而血浆蛋白质组中有22种高丰度蛋白约占血浆蛋白的99%，其中浓度最高的可以达到60～80 mg/mL[3]。即使很少的血液污染都会引入大量的血浆高丰度蛋白到组织样品中，在质谱检测时低丰度蛋白会受到高丰度蛋白的抑制，而很多疾病的生物标志物都是组织中的低丰度蛋白[4]，因此去除高丰度蛋白会有助于低丰度蛋白的检测。因此，本研究利用抗原抗体亲和的方法除去甲状腺、垂体组织中的12种血清高丰度蛋白，通过与未处理样品比较，定性定量分析所鉴定到的多肽和蛋白质，阐述去除血清高丰度蛋白方法对不同组织蛋白质组鉴定效果的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

二硫苏糖醇(Dithiothreitol, DTT)和碘乙酰胺(Iodoacetamide，IAA)(Sigma公司)；除12中血清高丰度蛋白抗体柱(Thermo 公司)(十二种高丰度蛋白：白蛋白、载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、纤维蛋白原、免疫球蛋白A、免疫球蛋白B、免疫球蛋白M、转铁蛋白、触珠蛋白、α1酸糖蛋白、α1抗胰蛋白酶和α2微球蛋白)；牛血清白蛋白(BSA)(北京鼎国生物技术有限公司)；质谱级胰蛋白酶(Promega公司)； 色谱级乙腈、甲酸和碳酸氢铵(Merk公司)。

1.2 组织蛋白的提取及蛋白浓度

将取自北京协和医学院遗体捐献站的甲状腺及脑库的垂体组织剪碎，用磷酸盐缓冲液反复涡旋清洗组织中的血液，直至组织中无可见血液成分，用裂解液(7 mol/L尿素, 2 mol/L硫脲,0.1 mol/L DTT, 50 mmol/L Tris)溶解组织蛋白，14 000×g离心10 min，保留上清，应用考马斯亮蓝法测蛋白浓度。

1.3 去除组织样品中血清高丰度蛋白

每种样品重复2次去除血清高丰度蛋白。甲状腺、垂体样品直接加到除12种血清高丰度蛋白抗体柱上，将抗体柱放于上下翻转器上。在温和的翻转条件下，室温孵育1 h后，1 000×g离心2 min，收集离心下来的低丰度样品。两次除高丰度蛋白得到的甲状腺、垂体样品，分别用10 ku套管将溶液置换为裂解液，用考马斯亮蓝法测蛋白浓度(方法同1.2)，计算低丰度蛋白的回收率。

1.4 一维胶分离

除高丰度蛋白得到的样品和原样加入还原剂和上样缓冲液，在100 ℃条件下加热5 min,应用4%～12% SDS胶分离，恒压200 V，时间35 min。用考马斯亮蓝染色。Alpha凝胶成像系统成像。

1.5 蛋白质酶切

甲状腺、垂体低丰度样品以及原样分别用膜上酶切方法结合微波辅助酶切方法进行酶切[5- 6]。方法如下：样品用终浓度为20 mmol/L的DTT在37 ℃时还原1 h，用终浓度为50 mmol/L的IAA在室温下避光烷基化45 min。以1∶50的比例加入胰蛋白酶。在水浴的条件下，850 W微波1 min。所得肽段抽干备用。

1.6 质谱分析

酶切后肽段溶于1‰甲酸中，多肽用反相毛细管液相色谱柱(75 μm×100 mm, 3 μm)。洗脱梯度5%～30%流动相(0.1%甲酸，99.9%乙腈，pH 2，流速0.3 μL/min)。分离后的多肽用LTQ Orbitrap Velos质谱进行检测，全扫描范围为300～2 000 amu(1个微扫描)，之后为20个信号依赖二级扫描(扫描宽度为3 amu，35%标准化能量碰撞，动态排除1 min)。每个样品重复分析3次。所得质谱数据用Mascot(V2.3.02)软件进行分析，所用数据库为SwissProt人类数据库，检索参数如下：胰蛋白酶，误切位点为2，肽段电荷数2+、3+、4+，肽段质量误差10 ppm，MS/MS质量误差0.1 u,固定化修饰脲甲基化Carbamidomethy(C)。所得数据用Scaffold进行筛选，在蛋白水平的假阳性率小于1%，每个蛋白至少有2个特异性肽段。用Progenesis进行非标记定量分析。

2 结果

2.1 去除血清高丰度蛋白后的蛋白回收率

甲状腺、垂体样品分别用去除12种血清高丰度蛋白抗体柱处理两次，两次低丰度样品回收率没有明显差异。甲状腺低丰度蛋白的回收率为57.25%±0.35%；垂体低丰度蛋白回收率为40.02%±4.27%。说明该方法具有良好的重复性。

M.marker; T.raw thyroid; P.raw pituitary; T-L1,T-L2.low abundant proteins of thyroid in two repetition; P-L1,P-L2.low abundant proteins of pituitary in two repetition图1 甲状腺(T)、垂体(P)样品除高丰度蛋白前后一维胶结果Fig 1 One-dimensional gel of thyroid and pituitary before (raw) and after serum high abundant proteins immunodepletion

2.2 去除血清高丰度蛋白样品和原样的一维胶结果

一维胶结果显示，甲状腺、垂体低丰度样品与原样相比，大部分条带没有明显变化，低丰度样品中的白蛋白(60～80 ku)条带消失(图1)。利用非标记定量方法所得到的峰面积作为定量标准，比较低丰度样品和原样中12种蛋白的相对量。甲状腺和垂体去除高丰度蛋白后的样品中12种血清高丰度蛋白与原样相比，分别被除去了92.11%±12.87%和78%±25%(表1)，说明可以去除大部分组织中的血清高丰度蛋白，对血运丰富的组织效果会更明显。

2.3 低丰度样品和原样定性分析结果

甲状腺低丰度样品和原样分别鉴定到多肽数(1 757±40)、(964±25)个，蛋白数(293±4)、(227±6)个。垂体低丰度样品和原样分别鉴定到多肽数(2 919±173)、(2 513±21)个， 蛋白数(655±10)、(674±1)个。对比3次质谱分析鉴定到的甲状腺、垂体样品的非冗余多肽和蛋白数，甲状腺低丰度样品比原样多鉴定70%多肽和16.5%蛋白(图2A，C)；垂体低丰度样品比原样多鉴定21.9%多肽，鉴定的蛋白数并无明显变化(图2B, D)。

A, B.peptides of thyroid and pituitary; C,D.proteins of thyroid and pituitary图2 甲状腺、垂体样品鉴定的非冗余肽段、蛋白分析Fig 2 The analysis of non-abundant peptides and proteins from thyroid and pituitary

proteinnamethyroidpituitaryrawlowlow/rawrawlowlow/rawalpha⁃1⁃acidglycoprotein117E-0320E-04102%10E-0311E-0384%alpha⁃1⁃acidglycoprotein2nonono50E-0500fibrinogenalphachain21E-0320E-04117%40E-0420E-0446%alpha⁃1⁃antitrypsin45E-0370E-0515%80E-0400haptoglobin66E-030080E-0400alpha⁃2⁃macroglobulinnonono10E-0350E-0438%apolipoproteinA⁃Ⅰ21E-030020E-0340E-0421%apolipoproteinA⁃Ⅱnonono50E-0700serotransferrin70E-0430E-04422%20E-0350E-0429%serumalbumin75E-0252E-037%11E-0124E-0223%IgkappachainⅤ⁃ⅠregionAG10E-040010E-0400IgheavychainⅤ⁃Ⅲregion70E-050080E-0530E-0538%Igalpha⁃1chainCregion40E-0430E-0563%30E-0330E-0411%

A.thyroid; B.pituitary; volcano plot showingPvalues (-log10) versus the quantitative ratio between low abundant and raw samples (log2)

图3 甲状腺和垂体低丰度与原样样品的定量分析

Fig 3 Quantitative analysis of low abundant and raw samples from thyroid and pituitary

2.4 定量分析低丰度蛋白和原样共同鉴定到的蛋白

非标记定量中，甲状腺和垂体样品低丰度样品与原样分别共同定量了226和454个蛋白。火山图分析结果表明：甲状腺低丰度样品鉴定到的蛋白中有68个高于原样(占定量蛋白的30.1%)，69个低于(占定量蛋白的30.5%)原样中这种蛋白的相对量(图3A)，垂体低丰度样品中89个高于原样(占定量蛋白的19.6%),100个低于(占定量蛋白的22.0%)原样(差异倍数：2，P<0.05)(图3B)。

3 讨论

蛋白质组学研究中，高丰度蛋白会抑制低丰度蛋白的鉴定，在血浆蛋白质组研究中通常去除高丰度蛋白[7]。组织取样时，容易受到血液的污染，引入血清中的高丰度蛋白。去除血清高丰度蛋白，有可能会改善组织低丰度蛋白的鉴定，但目前没有相关研究的报道。因此本文通过对比血运密集的甲状腺和血运较少的垂体，去除高丰度蛋白前后多肽和蛋白的结果，阐述去除血清高丰度蛋白对组织蛋白质组鉴定的影响。

一维胶结果表明，去除血清高丰度蛋白后，甲状腺、垂体中白蛋白条带消失，主要蛋白条带没有变化。通过非标记定量分析，12种血清高丰度蛋白在组织中的含量明显低于原样。甲状腺中高丰度蛋白的去除效果优于垂体，说明此法可以去除组织中血清高丰度蛋白，且更适合血运密集的甲状腺样品。但处理后，甲状腺样品蛋白的鉴定数仍然较少，定量分析表明甲状腺中仍存在高丰度蛋白：甲状腺球蛋白[8](低丰度样品中占71.92%，原样中占58.19%)。处理后它的含量明显提高，影响其他低丰度蛋白的鉴定，因此，为了得到更好的鉴定结果，应除去甲状腺中的甲状腺球蛋白。

定性分析表明，去除高丰度蛋白可以提高甲状腺肽段和蛋白以及垂体肽段的鉴定数。并说明该法对血运密集的甲状腺更适用。定量分析及蛋白回收率分析显示：该方法可以提高部分低丰度蛋白在样品中的相对量，有利用质谱检测，这种提高在血运密集的甲状腺中更明显，但会造成部分低丰度蛋白的损失。

通过质谱定性定量分析，除血清高丰度蛋白方法更适合血运密集的甲状腺样品，能提高鉴定的肽段和蛋白数。但该方法会导致样品损失，处理后的部分低丰度蛋白较原样显著降低，可能是由于蛋白的相互作用，使部分低丰度蛋白共同吸附到抗体柱上造成。因此，除血清高丰度蛋白的方法需要优化，以减少非特异性吸附的低丰度蛋白损失。同时，由于个体差异及不同组织中蛋白特性不同，该方法需更大规模的验证。

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Impact of immunodepletion of serum high abundant protein on tissue proteome identification

ZOU Li-li1, LI Wen-ting2, WANG Dan-qi1, WANG Zhao1, SUN Wei1*

(1.Core Facility of Instrument, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS & PUMC, Beijing 100005; 2.Dept. of Human Anatomy and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS & PUMC, Beijing 100005, China)

Objective To analyze the impact of immunodepletion of serum high abundant protein on identification of tissue proteome. Methods Human thyroid and pituitary samples were disposed using 12 high abundant protein depletion antibody column. The low abundant proteins and raw samples were analyzed by LC/MS. Identified peptides and proteins were qualitatively and quantitatively analyzed. Results The serum high abundant proteins in thyroid and pituitary were depleted by 92.11%±12.87%, 78%±25% respectively. Compared with raw thyroid, the non-redundant peptide and protein identification of low abundant thyroid were respectively increased by 70%, 16.5%. The non-redundant peptide identification of low abundant pituitary was 21.9% higher than that of raw samples. But the protein identification was profile unchanged. Conclusions The immunodepletion of serum high abundant proteins can significantly improve peptide and protein identification and is more suitable for the tissues with intensive blood vessel.

thyroid proteome; pituitary proteome; serum high abundant protein immunodepletion; LC/MS analysis

2014- 12- 26

2015- 01- 13

国家重点基础研究发展计划(2013CB530805, 2014CBA02005)；中国科技部重点基础研究计划(2013FY114100)

1001-6325(2015)04-0439-05

R34

A

*通信作者(corresponding author)：sunwei1018@sina.com