维生素K1冻干标准物质的研制

张晓光， 黄 挺， 张 伟， 黄 亮， 全 灿， 李红梅， 杨 屹

（1.北京化工大学理学院，北京100029； 2.中国计量科学研究院，北京100029；3.广州计量检测技术研究院，广东广州510030）

维生素K1冻干标准物质的研制

张晓光1， 黄 挺2， 张 伟2， 黄 亮3， 全 灿2， 李红梅2， 杨 屹1

（1.北京化工大学理学院，北京100029； 2.中国计量科学研究院，北京100029；3.广州计量检测技术研究院，广东广州510030）

采用二甲基亚砜（DMSO）作为冻干标准物质的溶剂，以重量法准确配制维生素K1／DMSO溶液，再进行分装、冷冻干燥，经定性分析、定值分析、均匀性检验、稳定性考察和不确定度评定，研制了维生素K1冻干标准物质。以维生素K1纯度标准物质溶液为校准品，对得到的冻干物质进行了高效液相色谱法定值分析，冻干标准物质的准确定值结果为0.96mg／mL，相对扩展不确定度为7%。建立的维生素K1冻干标准物质研制方法，对于临床检验中维生素K1的准确测定和相关疾病的正确诊断治疗以及维生素K1长期保存具有重要意义。

计量学；维生素K1；标准物质；冷冻干燥；二甲基亚砜；高效液相色谱法

1 引 言

维生素K1（phylloquinone）促进骨的重建和钙的动员，是维持人体生理功能的重要营养素［1］。准确测定血清维生素K1对相关疾病的正确诊断以及治疗具有重要意义。研制带有准确纯度及不确定度水平的标准物质，可为临床检验、医学、营养学、卫生检验检疫等方面的测量和研究工作提供技术支持和量值溯源保障［2～4］。维生素K1的溶剂稳定性较差，干燥后的样品可以长期保存。冻干技术是基于冻结制品的升华来达到脱水的目的，由于干燥过程中没有液体，液体以固体状态直接升华，且在低温、低氧下进行，大多数生物反应停滞，使物料的原有结构和形状受到最小程度的破坏，从而得到具有优良品质的产品［5］。同时，二甲基亚砜（DMSO）是一种良好的有机溶剂，在18℃以下就能变成固态。利用DMSO作为溶剂溶解样品，冻干。不需要超低温预冷样品，提高了冷冻干燥的效率。本课题组根据国际标准化组织ISO导则35［6］，研制了维生素K1冻干标准物质。首先采用重量法溶解维生素K1，再分装，冻干，得到维生素K1冻干物质，以维生素K1纯度标准物质为参照，利用高效液相色谱法，对维生素K1冻干标准物质进行了定值分析。标准物质用户只需按规定在冻干标准物质中加入一定体积的溶剂，即可作为溶液标准物质使用。

2 实验部分

2.1 主要仪器与试剂

美国Agilent 1200型高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器（DAD）；Agilent6410型三重四级杆液相色谱质谱联用仪；冷冻干燥机（Christ ALPHA 1-2 LD plus，德国）；布鲁克公司Bruker Ascend 800核磁共振仪（带有5 mm CPQCI超低温探头）；Inertsil ODS-SP，250 mm×4.6 mm×5μm液相色谱柱（GL Science Inc.日本）。

维生素K1纯度标准物质由本课题组研制（中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所，99.2%，相对扩展不确定度0.6%（k=2））；氘代二氯甲烷（CD2Cl2）（Sigma-Aldrich公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；二甲基亚砜（DMSO）（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）；其余试剂为分析纯；实验用水皆为超纯水。

2.2 定性分析

采用液相色谱-质谱联用法和核磁共振法对维生素K1冻干标准物质主成分进行定性分析。

2.3 维生素K1冻干物质制备与定值

2.3.1 维生素K1冻干物质的制备

利用重量法准确配制1 mg／mL的维生素K1的纯度标准物质的DMSO溶液共100 mL，分装至100个2 mL的棕色玻璃瓶，每瓶1 mL，然后置于-20℃冰箱30 min，观察瓶内溶液完全凝固，立刻取出，置于冷冻干燥仪内，进行冷冻干燥4 h，观察瓶内样品被完全干燥后，取出样品，置于-20℃，避光，密封保存。

2.3.2 维生素K1冻干物质定值

冻干样品使用前放到室温平衡，并用1 mL DMSO复溶。同时用重量法准确配制1mg／mL的维

式中：cd为维生素K1冻干物质配制浓度，mg／mL；cr为维生素K1纯度标准物质配制浓度，mg／mL；Ar为维生素K1纯度标准物质液相峰面积；Ad为维生素K1冻干物质液相峰面积。

2.4 均匀性检验

根据ISO Guide 35（2006）的要求，对上述标准物质进行了均匀性检验。具体抽样检验方法为从每种标准物质中随机抽取15个包装，进行瓶间均匀性检验；每一瓶取3个子样，进行瓶内均匀性检验。检验方法为定值方法，使用测量数据计算均匀性引入的不确定度ubb。

2.5 稳定性考察

根据ISO Guide 35（2006），标准物质稳定性考察按先密后疏的原则，在一定时间间隔内选择定值方法，检测在规定条件下保存的标准物质复溶浓度随时间的变化情况，使用测量数据计算长期和短期稳定性引入的不确定度ults和usts。

长期稳定性：将维生素K1样品置于低温（4℃）储存条件，冻干样品置于-20℃储存条件下，分别在第1、3、6个月进行稳定性监测。每次取5个包装，每个包装取一个子样，测3次，计算平均值，把5个包装测量结果平均值作为检测结果。

短期稳定性：将维生素K1样品以及冻干样品置于50℃条件下，分别在第1、3、5、7天进行稳定性监测。具体检测方法与长期稳定性检测相同。

2.6 冻干标准物质不确定度分析

2.6.1 以纯度标准物质为标准用LC检测DMSO复溶后冻干物质浓度的不确定度

主要由维生素K1纯品标准物质的不确定度up和用LC多次检测得到冻干物质浓度的相对不确定度uLC引入。生素K1纯度标准物质甲醇溶液作为标准，利用高效液相色谱法分别测定冻干样品和标准样品的峰面积。高效液相色谱法条件：流动相为甲醇∶水（92∶8）等度洗脱；流速：1 mL／min；进样量：5μL；样品为1 mg／mL维生素K1甲醇溶液；检测波长：274 nm。根据式（1）可算出冻干样品的浓度大小

2.6.2 均匀性与稳定性相对不确定度

均匀性与稳定性相对不确定度计算方法参见ISO Guide 35（2006）要求。

2.6.3 冻干标准物质的不确定度

2.6.4 相对扩展不确定度（包含因子k=2）

3 结果与讨论

3.1 维生素K1定性分析

图1为维生素K1的质谱图，可以看出，质荷比m／z为451.5和187.10与文献［7，8］一致，可以初步对维生素K1定性。核磁共振结果见图2，图中横轴表示化学位移，纵轴表示共振强度。与维生素K1标准谱图相一致［9］，可以确认样品原料为维生素K1。

图1 维生素K1的质谱图

图2 维生素K1核磁共振谱图

3.2 维生素K1冻干物质的制备

制备维生素K1冻干物质过程中要考虑到以下几方面：（1）样品的稳定。因为样品不同，其稳定存在状态不同，维生素K1由于在溶液状态下的不稳定性，不能长期保存，这样给用户带来了困扰，而其干燥后的样品能长期保存。（2）干燥采用的方法。干燥样品的方法很多，而经冷冻干燥技术干燥后的样品结构和形状仅受到最小程度的破坏，从而得到具有优良品质的产品。（3）溶剂选择。能溶解维生素K1的溶剂很多（甲醇、乙醇等），但这些溶剂溶解的样品在冻干之前均需要在超低温下预冷，而DMSO作为一种良好的有机溶剂在18℃就能完全成为固态，从而直接可以进行冻干，减少了冷冻干燥的时间。

3.3 维生素K1定值分析

3.3.1 以高效液相色谱法（HPLC）对维生素K1定值

图3为维生素K1用DMSO复溶后的高效液相色谱图。以维生素K1纯度标准物质为标准，利用外标法测定复溶后的维生素K1冻干物质。利用测得标准品和样品的峰面积根据式（1）可得到冻干物质浓度大小。

图3 维生素K1的液相色谱定值谱图（检测波长274 nm）

4 定值结果以及不确定度评定

4.1 维生素K1冻干物质的定值结果

以维生素K1纯度标准物质配制的溶液为标准（1 mg／mL），根据式（1）定值冻干物质。结果见表1。

表1 LC定值结果 mg·mL-1

4.2 维生素K1冻干物质的均匀性检验

冻干物质均匀性检验结果及其不确定度ubb的计算见表2。

4.3 维生素K1冻干物质的稳定性考察

长期稳定性和短期稳定性结果以及不确定度见表3和4。

表2 均匀性检验结果 mg·mL-1

表3 长期稳定性检验结果 mg·mL-1

表4 短期稳定性检验结果 mg·mL-1

4.4 维生素K1冻干标准物质不确定度评定

4.4.1 LC检测复溶后冻干物质浓度的不确定度

主要由维生素K1纯品标准物质的不确定度up和用LC多次检测得到冻干物质的浓度的相对不确定度uLC引入，根据式（2），

4.4.2 维生素K1冻干标准物质的不确定度

主要由定值不确定度、样品均匀性不确定度、长期稳定性不确定度、短期稳定性不确定度引入，根据式（3）、式（4）：

相对扩展不确定度

维生素 K1冻干标准物质定值结果为0.96mg／mL，相对扩展不确定度为7%（k=2）。

5 结 论

本文以DMSO为溶剂，利用冷冻干燥技术制备了维生素K1冻干标准物质，同时用其纯度标准物质为标准，采用HPLC方法对冻干标准物质进行了定值分析，使得到的结果准确可靠。此外，还对维生素K1冻干标准物质进行了均匀性检验、稳定性考察、不确定度评定，确保了用户在不同时间、使用不同包装的该种标准物质时，所使用的量值及不确定度都是准确可靠的，制备得到样品能长期保存，用户使用时只需加入一定的DMSO复溶即可使用。对于维生素K1保存和准确测定具有重要意义。

］

［1］ 李向荣，方晓，陈青俊，等.反相液相色谱法同时测定食物中维生素K1和K2［J］.营养学报，1988，20（1）：72-75.

［2］ 李云巧，王东冬.稀土溶液标准物质的研制［J］.计量学报，2003，24（4）：348-351.

［3］ 马联弟，王晶，曹文祺，等.粮食中营养成分标准物质制备技术［J］.计量学报，2004，25（3）：275-277.

［4］ 杨梦瑞，戴新华，杨屹，等.冰冻人血清尿酸标准物质的研制［J］.计量学报，2010，31（1）：86-90.

［5］ Boss E A，Filho R M，Coseelli E.Freeze drying process：real time model and optimization［J］.Chemical Engineering and Processing，2004，43（12）：1475-1485.

［6］ ISO Guide 35：2006.Reference materials-General and statistical principles for certification［S］.

［7］ Véronique D，Mickael P，Francois L，et al.Quantitative determination of plasma vitamin K1by high-performance liquid chromatography coupled to isotope dilution tandem mass spectrometry［J］.Journal of analytical biochemistry，2010，401（1）：7-14.

［8］ Qin X S，Ai DW，Li D，et al.HPLC-APCI-MS for the determination of vitamin K1in human plasma：Method and clinical application［J］.Journal of Chromatography B，2008，875（2）：541-545.

［9］ National Institute of Advanced Industrial Science and Technology（AIST），Japan，Spectral Database for Organic Compounds［DB］.http：／／sdbs.db.aist.go.jp／sdbs／cgi-bin／direct_frame_top.cgi，2014-03-14.

Development of a Certified Reference Material for Lyophilized Vitam in K1

ZHANG Xiao-guang1， HUANG Ting2， ZHANGWei2， HUANG Liang3，QUAN Can2， LIHong-mei2， YANG Yi1
（1.College of Science，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China；2.National Institute of Metrology，Beijing 100029，China；3.Guangzhou Institute of Measuring and Testing Technology，Guangzhou，Guangdong 510030，China）

Dimethyl sulfone（DMSO）is firstly applied as the solvent for a lyophilized certified reference material（CRM）.Vitamin K1／DMSO solution is prepared by gravimetry，and is sub-divided and lyophilized，the lyophilized vitamin K1CRM is developed through qualitative analysis，quantitative analysis，homogeneity study，stability study and uncertainty evaluation.Certified value of lyophilization vitamin K1is analyzed by high performance liquid chromatography method，using the vitamin K1purity CRM as a calibrant.The certified value is0.96 mg／mL，with the relative expanded uncertainty of7%.Themethod of CRM lyophilized vitamin K1makes great significance for the accurate determination the disease in clinical examination and the long-term preservation of vitamin K1.

Metrology；Vitamin K1；Certified referencematerial；Lyophilized；Dimethyl sulfone；High performance liquid chromatography

TB99

：A

：1000-1158（2015）03-0333-04

10.3969／j.issn.1000-1158.2015.03.23

2014-03-14；

：2015-02-16

国家科技支撑计划课题（2013BAK10B01）

张晓光（1988-），男，云南大理人，北京化工大学硕士生，主要从事分析化学方面的研究。zxg_4545＠126.com