培养液中不同蛋白添加物对IVF／ICSI-ET 植入前胚胎发育及临床妊娠结局的影响

唐宁，孔令北，刘海萍，王建业＊

（1.济南军区总医院生殖医学中心，济南 250031；2.山东济宁兖州区第一中学生物组，济宁 272100）

在体外受精-胚胎移植（IVF-ET）中，获得高质量、发育潜能良好的胚胎是得到好的临床妊娠结局的关键。一直以来，认为培养液的质量是体外胚胎培养的关键，这包括培养液的温度、渗透压、pH 值以及培养液的组成成分等［1-8］。而在培养液的组成成分中，蛋白添加物必不可少。血清替代补充成分（SSS）和人血清白蛋白（HSA）是两种非常常用的蛋白添加物，有必要对其在体外受精／卵胞浆内单精子注射-胚胎移植（IVF／ICSI-ET）中的作用作进一步地探讨。

一、材料与方法

1.研究对象：回顾性分析2013年5月1日至2013年9 月30 日 及2014 年5 月1 日 至2014 年9月30 日在本中心行IVF／ICSI-ET 的患者。所有纳入患者均使用短方案超排卵，女方不孕因素为输卵管因素，移植日为取卵后第3天。所有患者均施行新鲜胚胎移植。

2.分组：本中心所有胚胎培养均使用瑞典Vitrolife序贯培养液。根据培养液蛋白添加物的不同，将患者分为HSA 组（以10%HSA 作为胚胎培养液添加物）和SSS组（以20%SSS作为胚胎培养液添加物），其中2013年的患者为HSA 组，而2014年的患者为SSS组。

3.诊疗方法回顾：使用本中心已建立的方法［9］。具体为：经本中心常规方法超排卵后，当主导卵泡直径达18 mm 时，肌肉注射HCG 5 000～10 000U；HCG 注射后36～40h，于超声引导下经阴道取卵；取卵后3～5h行IVF 或4～6h行ICSI授精，授精后18～20h观察受精情况；授精后68～70h观察胚胎卵裂球的数目和碎片多少，并以此为根据判定胚胎的级别，分为Ⅰ级胚胎（卵裂球大小均匀，胞浆碎片＜10%）、Ⅱ级胚胎（卵裂球大小略不均匀，胞浆碎片＜15%）、Ⅲ级胚胎（胞浆碎片＜50%，卵裂球的情况类似于Ⅱ级胚胎）和Ⅳ级胚胎（胞浆碎片＞50%）。胚胎达6 细胞以上，Ⅰ级和Ⅱ级胚胎为优质胚胎。

取卵后第3 天进行ET，移植时优先选用优质胚胎。移植胚胎的数目严格按照国家标准，即：患者年龄＜35岁，移植2个胚胎；患者年龄≥35 岁或患者处于2个以上（包括2个）移植周期，移植3个胚胎。移植后给予黄体酮支持黄体功能，2周后测尿HCG，阳性者为生化妊娠，5周后B超检查胚囊数，见孕囊及胚芽即诊断为临床妊娠。

4.观察指标：将行IVF和ICSI的患者分别进行患者基本情况、胚胎发育和妊娠情况的比较，统计学分析其差异。患者的基本情况包括年龄、不孕年限、平均促性腺激素（Gn）量、Gn使用天数、获卵数；胚胎发育情况包括受精率、卵裂率、优质率、移植胚胎数和胚胎冷冻率；妊娠情况包括妊娠率和着床率。

IVF的受精率＝（双原核胚胎数＋单原核胚胎数＋多原核胚胎数）／总取卵数×100%；ICSI的受精率＝（双原核胚胎数＋单原核胚胎数＋多原核胚胎数）／MⅡ期卵母细胞数×100%；卵裂率＝卵裂胚胎数／（双原核胚胎数＋单原核胚胎数＋多原核胚胎数）×100%；优胚率＝优质胚胎数／卵裂胚胎数×100%；妊娠率＝临床妊娠数／患者总人数×100%；着床率＝孕囊或胚芽数／移植胚胎总数×100%；胚胎冷冻率＝移植后有冷冻胚胎的病例数／总例数×100%。

5.统计方法：使用SPSS 10.0进行分析。定量资料结果以平均值±标准误表示；定量资料使用成组设计的t检验，定性资料使用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.行IVF-ET 的患者：SSS 组与HSA 组的患者年龄、不孕年限、平均Gn量、使用天数和获卵数均无统计学差异（P＞0.05）（表1）；两组患者的受精率、卵裂率、移植胚胎数、妊娠率和着床率均无统计学差异（P＞0.05），而SSS组的胚胎冷冻率、优胚率均显著高于HSA 组（P＜0.05）（表2）。SSS可促进植入前胚胎的发育但不能改善IVF-ET 临床妊娠结局。

2.行ICSI-ET的患者：SSS组与HSA 组在不孕年限、平均Gn量和使用天数上无统计学差异（P＞0.05），但SSS组患者年龄显著高于HSA 组（P＜0.05），且SSS组的获卵数显著低于HSA 组（P＜0.05）（表3）；两组患者受精率、卵裂率和妊娠率均无统计学差异（P＞0.05），但SSS组的冷冻率和优胚率均显著高于HSA 组（P＜0.05），而SSS组着床率显著低于HSA 组（P＜0.05）（表4）。SSS能促进ICSI后胚胎早期发育，提高卵母细胞的利用率。

3.年龄对行ICSI-ET 的患者妊娠情况的影响：由于SSS组患者的年龄高于HSA 组、着床率低于HSA 组，为进一步探讨年龄对妊娠结局的影响，接受ICSI的患者按年龄分成＜35 岁组和≥35岁组，对不同年龄组中SSS和HSA 对妊娠结局的影响分别进行分析。结果显示，无论在＜35岁 组 中，还 是 在≥35 岁 组 中，SSS 和HSA 对妊娠率和着床率的影响均无统计学差异（P＞0.05）（表5）。

表1 IVF患者基本情况（±s）

表1 IVF患者基本情况（±s）

组 别 例数 年龄（岁） 不孕年限（年） 平均Gn量（支） 使用天数（d） 获卵数（个）12 9.89±0.27 SSS组 622 31.65±0.21 4.06±0.11 27.91±0.42 9.83±0.HSA 组 467 31.83±0.24 4.15±0.14 27.34±0.53 9.66±0.11 9.62±0.24

表2 IVF患者胚胎发育及妊娠情况［（±s），%］）

表2 IVF患者胚胎发育及妊娠情况［（±s），%］）

注：与HSA 组比较，＊P＜0.05

组别 例数 胚胎总数（个）受精率 卵裂率 优胚率 移植胚胎数（个）着床率 妊娠率 胚胎冷冻率.66 68.74 SSS组 622 5 983 79.13 94.38 63.20＊ 1.98±0.036 34.34 53.72 76.58 HSA 组 467 4 618 79.78 94.13 50.39 2.01±0.034 33.16 49＊

表3 ICSI患者基本情况（±s）

表3 ICSI患者基本情况（±s）

注：与HSA 组比较，＊P＜0.05

组别 例数 年龄（岁） 不孕年限（年） 平均Gn量（支） 使用天数（d） 获卵数（个）14 9.35±0.31 SSS组 457 32.76±0.28＊ 4.46±0.17 27.20±0.51 9.26±0.13 8.28±0.26 HSA 组 286 30.03±0.31 4.51±0.20 28.01±0.58 9.53±0.＊

表4 ICSI患者胚胎发育及妊娠情况［（±s），%］）

表4 ICSI患者胚胎发育及妊娠情况［（±s），%］）

注：与HSA 组比较，＊P＜0.05

组别 例数 胚胎总数（个）受精率 卵裂率 优胚率 移植胚胎数（个）着床率 妊娠率 胚胎冷冻率18 60.09 SSS组 457 3 784 86.05 95.92 61.80＊ 2.00±0.04＊24.29＊ 41.95 68.29 HSA 组 286 2 674 84.79 95.07 51.12 2.19±0.04 29.23 46.＊

表5 两种蛋白添加物对不同年龄组ISCI患者妊娠情况的影响（%）

三、讨论

胚胎的生长环境，尤其是培养胚胎的培养液一直是IVF-ET 的关键。一旦出现不理想的临床妊娠结局，辅助生殖工作者首先考虑的就是胚胎培养液是否出了问题或者培养环境是否有变化。一直以来，研究者都在不停地研究如何改进现有的培养液，以期获得更好的、有发育潜能的胚胎，进而改善临床妊娠结局。胚胎培养液中蛋白添加物的加入有助于获得更好的优质胚胎。培养液中最早使用的蛋白添加物是母源性的血清蛋白，而后发展为人血清白蛋白（HSA 和Buminate），再后人们开始使用蛋白替代物（包 括SSS、SPS、LGPS 等）。现 在，HSA 和SSS是各生殖中心胚胎培养最常用的蛋白添加物。

1995年有研究显示，和HSA 相比，添加了SSS的胚胎培养液在提高受精率和胚胎形态学质量方面并没有优势［10］，但第2年对小鼠的研究则证实，SSS能促进小鼠胚胎生长，具有和血清同样的效果［11］，而同年的临床回顾性分析研究则表明：相对于母源血清和人血浆蛋白粉（Plasmanate），SSS 能提高胚胎的种植率，从而获得更好的临床妊娠结局［12］。2009年，有研究者证明，与单纯添加HSA 相比，SSS和HSA 的共同添加能提高胚胎的植入率并能提高最终的活产率［13］。与前述研究相一致的是，我们的研究表明：与HSA 相比，SSS能促进IVF／ISCI后植入前胚胎的发育，增加优质胚胎和可用胚胎的数量，提高所获取的卵母细胞的利用率。冷冻胚胎的增多意味着患者若在本治疗周期未获得妊娠，可以使用自然周期或者人工周期准备内膜，而后进行胚胎复苏移植，大大节省治疗的时间和患者的花费。

但我们的研究同样也表明，在IVF-ET 中，SSS的加入并没有提高胚胎的植入率，也未改善临床妊娠结局，这可能与移植时都是尽量选用优质胚胎有关。在ICSI-ET 患者中，SSS组的植入率甚至要低于HSA 组，这可能是因为SSS组患者的年龄显著地高于HSA 组。而后分年龄阶段的统计分析显示，在不同年龄组（＜35 组和≥35 岁组），SSS 和HSA 对临床妊娠率和胚胎着床率的影响没有统计学差异，进一步证实ICSI组临床妊娠结局的主要是受患者年龄的影响。而造成年龄差异的根本原因可能是自2013年底，山东省通过了单独二孩的计划生育政策，这使得大量年龄偏大的育龄妇女求助于辅助生殖技术来实现自己的二胎梦，年龄的偏大造成了卵巢功能的低下，超排卵后获得的卵母细胞数目也明显减少，以至于在移植时可用胚胎的数目也明显降低。

对SSS作用机理的研究显示，培养液中SSS的加入可以提高囊胚的孵出率，降低活性氧自由基的水平，减少胚胎卵裂球的凋亡［14］，此外SSS对植入前胚胎发育的促进作用也可能与SSS 中氨基酸含量较高有关［15］。

总之，SSS能促进IVF／ICSI-ET 中植入前胚胎的发育，提高卵母细胞的利用率，可以作为优化胚胎培养方案的蛋白添加物。

［1］ Hong KH，Lee H，Forman EJ，et al.Examining the temperature of embryo culture in in vitro fertilization：a randomized controlled trial comparing traditional core temperature（37 ℃）to a more physiologic，cooler temperature（36 ℃）［J］.Fertil Steril，2014，102：767-773.

［2］ Lee JS，Kim JH，Seo YS，et al.The influence of serum substituents on serum-free Vero cell conditioned culture media manufactured from Dulbecco’s modified Eagle medium in mouse embryo culture［J］.Obstet Gynecol Sci，2013，56：320-329.

［3］ Hentemann M，Mousavi K，Bertheussen K.Differential pH in embryo culture［J］.Fertil Steril，2011，95：1291-1294.

［4］ Swain J.Embryo culture and pH［J］.Fertil Steril，2011，95：e67-e68.

［5］ Swain JE.Optimizing the culture environment in the IVF laboratory：impact of pH and buffer capacity on gamete and embryo quality［J／OL］.Reprod Biomed Online，2010，21：6-16.

［6］ Swain JE，Pool TB.New pH-buffering system for media utilized during gamete and embryo manipulations for assisted reproduction［J／OL］.Reprod Biomed Online，2009，18：799-810.

［7］ Edwards LJ，Williams DA，Gardner DK.Intracellular pH of the preimplantation mouse embryo：effects of extracellular pH and weak acids［J］.Mol Reprod Dev，1998，50：434-442.

［8］ Johnston LA，Donoghue AM，O’Brien SJ，et al.Influence of temperature and gas atmosphere on in-vitro fertilization and embryo development in domestic cats［J］.J Reprod Fertil，1991，92：377-382.

［9］ 唐宁，王建业，吕丹，等.授精后24-25h原核融合与IVF／ICSI-ET中胚胎早期发育和妊娠结局的相关性研究［J］.中国优生与遗传杂志，2013，21：121-123.

［10］ Graham MC，Partridge AB，Lewis V，et al.A prospective comparison of Synthetic Serum Substitute and human serum albumin in culture for in vitro fertilization-embryo transfer［J］.Fertil Steril，1995，64：1036-1038.

［11］ Tucker KE，Hurst BS，Guadagnoli S，et al.Evaluation of synthetic serum substitute versus serum as protein supplementation for mouse and human embryo culture［J］.J Assist Reprod Genet，1996，13：32-37.

［12］ Desai NN，Sheean LA，Martin D，et al.Clinical experience with synthetic serum substitute as a protein supplement in IVF culture media：a retrospective study［J］.J Assist Reprod Genet，1996，13：23-31.

［13］ Meintjes M，Chantilis SJ，Ward DC，et al.A randomized controlled study of human serum albumin and serum substitute supplement as protein supplements for IVF culture and the effect on live birth rates［J］.Hum Reprod，2009，24：782-789.

［14］ Esfandiari N，Falcone T，Agarwal A，et al.Protein supplementation and the incidence of apoptosis and oxidative stress in mouse embryos［J］.Obstet Gynecol，2005，105：653-660.

［15］ Morbeck DE，Paczkowski M，Fredrickson JR，et al.Composition of protein supplements used for human embryo culture［J］.J Assist Reprod Genet，2014，31：1703-1711.