新疆贝母属8种药用贝母遗传多样性ISSR分析

詹羽姣，盛 萍，姚 蓝，史 红，张 煊

(新疆医科大学中医学院，新疆乌鲁木齐 830011)

贝母是一种常用中药，在我国有悠久的用药历史［1］。2010年版《中国药典》收载的贝母药材有川贝母、浙贝母、伊贝母等，其中伊贝母包括新疆贝母Fritillaria walujewii、伊犁贝母 F.pallidiflora 2种植物的干燥鳞茎［2］。在临床应用方面与川贝母相同，是中医处方和中成药生产常用的名贵药材。因其野生品种仅分布在新疆［3］，故新疆当地人也将此2种植物的干燥鳞茎统称为新疆贝母。而实际上，在民间，新疆分布量较丰富的其他6种贝母如黄花贝母F.verticillaea、额敏贝母F.meleagris等的干燥鳞茎也同时入药使用，导致国内药材市场一直处于新疆贝母品种严重混乱现状，而贝母属植物鳞茎形态较为相似，难以用传统鉴别方法鉴定药材品种，临床疗效令人堪忧。

目前对新疆贝母属药用植物的研究，主要集中在化学成分、生物碱类成分含量测定、药理作用等方面［4－6］。而ISSR这种新型分子标记技术，也已广泛应用于植物品种鉴定及遗传多样性分析等研究中［7－9］。但有关新疆贝母属药用植物的ISSR分子标记的报道仅见于王果平等对新疆贝母属植物的初步研究［10］，然而，这些对于新疆贝母属药用贝母遗传多样性分析及种的准确鉴定仍显不足。本文运用ISSR分子标记技术，采用POPGEN和NTSYS软件对新疆贝母属分布量较丰富的8种药用贝母进行遗传多样性综合分析，拟从DNA分子特证进行品种分类鉴别，探讨新疆分布广泛的8种药用贝母种间亲缘关系，促进新疆贝母属药用贝母的合理利用及资源保护，为保证临床安全、合理用药提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

Plant Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH)(离心柱型)试剂盒，Taq DNA 聚合酶，dNTPs，Mg2+，10 × Buffer，2000kb DNA Marker，Gelview 等。引物根据加拿大哥伦比亚大学公布的第9套ISSR引物序列，由上海生工有限公司合成。实验材料于2012年5～6月从新疆不同产地采集，经新疆贝母专家段咸珍及新疆医科大学盛萍教授鉴定，样品信息见表1，凭证标本存放于新疆医科大学中医学院中药资源教研室。

表1 新疆贝母属8种药用贝母种质来源信息表

1.2 仪器

Anke TGL－16C离心机(上海安亭科学仪器厂);DYY－7C型电泳仪(北京六一仪器厂);Bio－Rad C1000 PCR扩增仪(BIO－RAD美国);琼脂糖凝胶成像仪(上海培清科技有限公司)等。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 基因组总DNA提取及检测

采用试剂盒Plant Genomic DNA Kit(离心柱型)进行植物基因组总DNA的提取(方法经课题组比较后选定)，操作步骤参照说明。提取后用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其DNA的完整性，用核酸蛋白测定仪检测其浓度及纯度，并将总DNA浓度稀释至50 ng/μL至4℃冰箱备用。

2.1.2 扩增程序及成像

选取2份材料(新疆贝母、伊犁贝母)进行预实验，从74条引物中筛选出16条条带清晰，多态性丰富且重复性较好的引物用于全部样品的PCR扩增(表2)。采用课题组已优化的ISSR－PCR反应体系(50 μL 体系):2.50 mmol/L Mg2+，0.30 mmol/L dNTPs，0.80 μmol/L Primer，0.75 U Taq DNA 聚合酶，1.00 ng/μL 模板 DNA，5 μL 10 × Buffer，33.4 μL ddH2O。扩增程序:95℃预变性7 min;95℃变性30 s;退火(根据不同引物设定温度)45 s;72℃延伸90 s;45个循环;72℃延伸10 min;4℃保存。扩增所得产物用Gelview染色，DL2000 DNA Marker作相对分子质量标准，用2%的琼脂糖凝胶于115 V电压下电泳50 min，在紫外凝胶成像系统下观察拍照。

2.1.3 数据统计及分析

ISSR电泳结果采用0/1赋值记带，有电泳带(包括强带和弱带)记为“1”，无电泳带记为“0”。形成0/l矩阵图输入计算机。用Popgene32软件分析得到遗传结构和遗传多样性参数，利用NTSYSPC软件进行聚类分析，用SHAN程序构建聚类图。

2.2 结果与分析

2.2.1 ISSR扩增结果多态性分析

新疆贝母属8种药用贝母23份样品的ISSRPCR扩增电泳结果产生了清晰的条带，部分引物扩增结果见图1。16条引物共扩增出199条条带，扩增片段长度多集中在250～1600 bp，其中195条具有多态性，多态性比率(PPB)为97.99%，不同引物扩增出的条带数在6～20条，多态性条带在5～20条，每个引物的多态性百分率为83.33% ～100%，引物序列、扩增结果及多态性见表2。其中，引物4与引物SSR1的扩增图谱可独立将8种药用贝母区分开，16条引物扩增结果中，13条引物里均出现药用贝母的特异性条带，即与其余药用贝母相比较，托里贝母在引物UBC825中多出一条800 bp的条带，在引物UBC822中缺少一条750 bp的条带;滩贝母在引物UBC822中多出一条350 bp的条带，引物UBC900中多出一条250 bp的条带;大白花贝母在引物4中缺少一条500 bp的条带，在此相同引物的450 bp处新疆贝母缺此条带;额敏贝母在引物UBC849中多出一条200 bp的条带，同时在引物UBC868中缺少一条600 bp条带;裕民贝母同时在引物UBC900的875 bp处和引物UBC899的500 bp处缺少条带，而在引物UBC855的200 bp处多出一条条带。

图1 部分引物对23份样品的扩增结果

表2 新疆贝母属8种药用贝母ISSR扩增结果和多态性分析

依据扩增条带最丰富的引物4和引物SSR1的扩增结果，分别作新疆贝母属8种药用贝母的ISSR标记检索表。(表3、表4)

表3 新疆贝母属药用贝母ISSR标记检索表

4.有550 bp条带·········滩贝母F.karelinii 4.无550 bp条带5.有850 bp条带·········额敏贝母F.meleagroides 5.无850 bp条带·········托里贝母F.tortifolia 2.无500 bp条带3.有600 bp条带·········伊犁贝母F.pallidiflora 3.无600 bp条带4.有800 bp条带··········新疆贝母F.walujewii 4.无800 bp条带··········大白花贝母F.verticillata var.albidoflora

表4 新疆贝母属药用贝母ISSR标记检索表

2.无1000 bp条带··········滩贝母F.karelinii

2.2.2 新疆贝母属8种药用贝母遗传多样性分析

采用Popgene32软件对新疆贝母属8种药用贝母共23份样品进行分析(见表5)，结果显示8种药用贝母各品种间的多态性位点百分率(PPB)介于1.01% ～45.23%，其中托里贝母的多态性位点百分率(45.23%)最高，裕民贝母的多态性位点百分率(1.01%)最低。23份贝母的等位基因数(Na)为1.9799 ±0.1407，有效等位基因数(Ne)为1.5230 ±0.3369，Nei’s多样性指数(H)为 0.3084 ±0.1615，Shannon’s信息指数(I)为 0.4669 ±0.2064，表明大部分药用贝母在DNA分子水平上有较高的遗传多样性。

表5 新疆贝母属8种药用贝母的遗传多样性

2.2.3 新疆贝母属8种药用贝母的遗传分化

计算8种药用贝母的遗传分化水平，结果显示其总的基因多样度(Ht)为0.3146±0.0265，遗传多样度(Hs)为0.0904±0.0043，居群间的遗传分化指数(Gst)为0.6985，即总的遗传变异中有69.85%存在于其品种间，30.15%存在于其品种内，说明新疆贝母属8种药用贝母的遗传多样性变异大部分存在于不同的品种间。基因流(Nm*)为0.2159，表明不同品种间的基因交流程度有限。

2.2.4 8种药用贝母聚类分析及亲缘关系

新疆贝母属8种药用贝母通过UPGMA法进行聚类分析(见图2)，显示品种间遗传相似系数介于0.58～0.99，每份材料均可被明显区分开来。在GS为0.64处可将23份材料聚为四类，第一类有两个品种，包括新疆贝母、伊犁贝母;第二类有三个品种，包括黄花贝母、托里贝母、大白花贝母;第三类有两个品种，包括额敏贝母、裕民贝母;第四类有一个品种，滩贝母。由遗传相似性可以看出，采集的大部分贝母具有较高的遗传多样性，每份样品的分类也正与其品种的来源相符。

为进一步分析新疆贝母属8种药用贝母间的遗传分化程度，计算其Nei’s遗传一致度(I)和遗传距离(D)见表6。从中可以看出其遗传一致度(I)介于0.6411 ～0.8536，遗传距离(D)介于0.1582 ～0.4446。新疆8种药用贝母中大白花贝母和托里贝母遗传一致度最高为0.8536，遗传距离最小为0.1582，说明其遗传差异较小，亲缘关系最近;额敏贝母和黄花贝母遗传一致度最低为0.6411，遗传距离最远为0.4446，其遗传差异较大，亲缘关系最远。

图2 新疆贝母属8种药用贝母材料基于ISSR分析的UPGMA聚类图

表6 新疆贝母属8种贝母遗传一致度(I对角线以上)和遗传距离(D对角线以下)

3 讨论

贝母属(Fritillaria L.)全世界约有130种，在我国有61种，50个变种，5变型，其中具药用价值的20余种，主要分布于四川、新疆、浙江等省。在新疆，贝母属药用贝母主要分布于新疆塔城地区、吉木萨尔县、新源县、霍城县、巩留县、吉木乃等的山区及草地，分布范围广泛，生态分布多样，具有较好的资源基础。本研究从新疆不同的产地选取药用贝母各2～4份，样品覆盖新疆贝母属药用贝母分布量较丰富的分布区，包含了新疆药材市场上最常用的8种药用贝母，对其遗传多样性进行研究。遗传多样性是每种生物所固有的特性，可以帮助了解物种的群体遗传结构和多样性水平，为研究物种起源、品种分类、品种保护及保证临床用药等提供依据［11］。而ISSR是检测物种遗传多样性的一种快速、高效的方法，结合了 SSR 和 RAPD 的优点［12－13］，具有操作简单、重复性好、信息量大等优点。

从ISSR－PCR扩增结果来看，新疆贝母属8种药用贝母的遗传多样性为97.99%，这与王果平的研究结果相一致［10］，说明新疆8种药用贝母具有较高的遗传多样性。同时，从ISSR－PCR扩增结果还可以看出，8种药用贝母在不同引物的位点处均能出现各自的特异性条带，引物4与引物SSR1均可独立将其区分开，并且引物4和引物SSR1制作的ISSR标记检索表可用于新疆贝母属8种药用贝母品种鉴定的检索，说明其在分子特征水平上可被鉴定区分开来。

新疆贝母属8种药用贝母中多态性比率最高的(45.23%)低于总体的遗传多态性(97.99%)，全部品种的等位基因数(Na):1.9799，有效等位基因数(Ne):1.5230，Nei’s 多样性指数(H):0.3084，Shannon’s信息指数(I):0.4669，都高于各品种间的数值，可看出采集的23份药用贝母具有较好的代表性。其中托里贝母的多态性比率(45.23%)高于了新疆贝母(39.70%)和伊犁贝母(35.18%)，滩贝母的多态性比率(34.17%)与新疆贝母和伊犁贝母的相近，说明托里贝母和滩贝母的遗传纯度较高。额敏贝母、裕民贝母的多态性位点百分率很低，分别为5.03%和1.01%，其采集状况又均为野生，说明自然环境或人为破坏对其的生长产生了影响，种质退化比较严重，存在着遗传风险，必须采取有力的措施来有效的保护野生种质。从新疆贝母属8种药用贝母的遗传分化水平可揭示，遗传变异中有69.85%存在于不同品种间，品种间的基因交流有限，存在着遗传分化。

根据Nei’s遗传距离对新疆贝母属8种药用贝母进行聚类分析，所得聚类图显示其各品种间遗传相似系数介于0.58～0.99，可将23份材料聚为四类且正与其品种来源相符，新疆贝母、伊犁贝母为第一类，即为伊贝母;黄花贝母、托里贝母、大白花贝母为第二类，说明黄花贝母、大白花贝母和托里贝母亲缘关系较近，这与罗毅波提出的大白花贝母为黄花贝母的变种相符合［14］，也与王果平和吴晓青的研究结果相一致［10，15］;额敏贝母、裕民贝母为第三类，这与王果平将新疆贝母、伊犁贝母、裕民贝母聚为一类，额敏贝母为一类的研究不尽相同［10］;滩贝母单独分为第四类。通过Nei’s遗传一致度(I)和遗传距离(D)的分析显示大白花贝母和托里贝母遗传差异最小，额敏贝母和黄花贝母亲缘关系最远。这与吴晓青提出的裕民贝母与托里贝母关系较近和Leon提出的裕民贝母与黄花贝母关系最近的研究结果有一定差异［14，16］。造成此类差异的原因可能是与受试材料的选择不尽一致;采集地点和采集时间的不同;采集的种质状况及采样数量不同有关。

被誉为止咳润肺“圣药”的贝母属植物，随着中药市场的不断发展和人民日常生活的需要，贝母已成为价格昂贵供求紧张的中药材之一。随着新疆野生伊贝母药材资源破坏严重，在新疆同时入药使用的其他野生和栽培药用贝母几十年来不仅供应本区，还大量支援其他兄弟省区，以弥补市场的紧缺和供需矛盾。从新疆贝母属药用贝母的现状来看，大部分的遗传纯度已经达到较高的水平，多态性与新疆贝母和伊犁贝母无明显差异，总体上均具有较丰富的遗传多样性，遗传纯度较高，有望增补为伊贝母项下新品种。这一现象也有利于扩大新疆贝母资源，为保证临床安全用药，合理用药提供了科学依据。

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