丁云花 宋曙辉 赵学志 王文琪 何洪巨
(北京市农林科学院蔬菜研究中心,农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,蔬菜种质改良北京市重点实验室,北京 100097)
花 椰 菜(Brassica oleraceaL. var.botrytisL.)是我国重要的十字花科芸薹属甘蓝类蔬菜,至2011年全球花椰菜总收获面积为120.95万hm2,其中我国收获面积达44.65万hm2,占36.92%,居世界第一位,成为世界第一大花椰菜生产国和消费国(李文萍 等,2014)。十字花科作物中含有一类重要的次生代谢物质——硫代葡萄糖苷(Glucosinolates,简称硫苷),它的降解产物具有多种生物学功能,不仅能有效预防和控制肺癌、大肠癌、乳腺癌、胰腺癌等多种癌症的发生和发展,对植物防御反应、预防和控制植物病害、调节生长素代谢、增强植物抗逆性等都有非常重要的作用(Oginsky et al.,1965;Bradfield & Bjeldanes,1984;Guo et al.,1992;Zhang et al.,1994;Tawfiq et al.,1995;Siemens & Mitchell-Olds,1996;Fahey & Talalay,1999;Hashem & Saleh,1999;Lin et al.,2000;Kliebenstein et al.,2002)。 因 此, 近年来十字花科作物中硫苷的组分、含量成为研究热点。何洪巨等(2002)对十字花科芸薹属中白菜类、芥菜类、甘蓝类蔬菜的硫苷组成与含量进行了比较分析,结果表明甘蓝类蔬菜中硫苷含量最高,白菜类蔬菜最低。孙秀波等(2007)对十字花科白菜类、甘蓝类、芥菜类、萝卜类蔬菜的硫苷含量进行了测定,结果表明甘蓝类蔬菜中硫苷含量最高,是白菜类和芥菜类蔬菜的10倍,是萝卜类蔬菜的15倍。
目前关于甘蓝、青花菜等甘蓝类蔬菜硫苷种类、含量及生物活性等相关研究的报道很多(Zhang et al.,1992;Fahey et al.,1997;Famham et al.,2000;Vallejo et al.,2002;季宇彬 等,2007;邹翔 等,2007;弓志青 等,2011;姚雪琴 等,2011;董莉 等,2012),但有关花椰菜硫苷方面的研究报道却很少见。然而,由于引进历史的长短和消费习惯的不同,我国花椰菜的栽培面积和消费量远远超过青花菜,仅次于甘蓝;而且近些年随着松花菜消费需求的猛增(顾宏辉 等,2012),我国花椰菜的生产面积和消费量逐年递增。因此,研究不同类型花椰菜中硫苷的组分和含量对于其品种和资源评价,靶向性选育富含某种硫苷的品种,开发保健型蔬菜具有十分重要的意义。
以往的研究表明,由于长期以来新品种选育大多沿着提高产量和改良味道的方向进行选择,导致甘蓝类蔬菜种内硫苷含量和种类也存在较大的差异。Gland等分析的367个B. oleracea材料中,不仅硫苷总量的变异范围非常大(1~200 μmol·g-1),而且硫苷的种类也不相同,有的是黑芥子硫苷酸钾型,有的却有着非常高的甲状腺素比例(傅廷栋,1982)。由此可以推断,花椰菜的硫苷种类和含量在不同品种之间也会存在一定的差异。本试验针对目前种植最广泛、消费最流行的3类花椰菜:松花菜、紧花菜和紫花菜品种的硫苷组分和含量进行比较分析,旨在为花椰菜品种和资源的营养评价及开发保健型新品种提供理论依据。
供试的15个花椰菜品种均由北京市农林科学院蔬菜研究中心提供,其中5个松花菜品种分别为庆农90、庆农80、京松85、京松75、京松65;5个紧花菜品种分别为津品70、京研60、雪宝、城场120、改良雪球;5个紫花菜品种分别为紫花1 号、紫花2号、紫花3号、紫花4号、紫花5号。
所有品种均于2015年1月5日播种,3月25日定植于本中心农场,采用露地平畦栽培,株距50 cm,行距50 cm,随机排列,3次重复,每重复30株。6月8日采收商品球,进行硫苷含量测定。
1.2.1 硫苷的提取 硫苷提取参考何洪巨等(2002)的方法,并做适当修改。取新鲜花球,分割成小块,真空冷冻干燥。称取冷冻干样0.2 g于15 mL离心管中,加入0.25 mL内标苯甲基硫苷和5 mL 预热的 100% 甲醇,80 ℃水浴 20 min,每隔 4~5 min 涡旋 1 次。3 000 r·min-1离心 10 min,取上清液,倒入另1个15 mL离心管中,冰浴保存;沉淀物继续用70%甲醇重复离心2次,合并上清液。取2 mL上清液,过DEAE离子交换柱(规格:A-25),然后用 0.02 mol·L-1醋酸钠溶液 2 mL 冲洗柱子。把柱子转移至另1个玻璃试管中,加入75 μL硫酸醋酶溶液,封口过夜。将过夜的柱子用0.5 mL双蒸水洗涤3次,洗出液经0.45 μm滤膜过滤,冷冻保存,待测。
1.2.2 硫苷的分析 采用HPLC分析法,分析条件:SHIMADZU-LC-20AD高效液相色谱系统,LC-20AD型梯度洗脱泵,SPD-20A型紫外检测器,检测波长 229 nm。采用 Waters C18色谱柱(3.9 mm×150 mm,4 μm), 柱 温 25 ℃, 进 样 量 10 μL;流动相A为0.05%四甲基氯化铵,流动相B为0.05%四甲基氯化铵(双蒸水∶乙睛=4V∶1V),按表1进行梯度洗脱,在31 min内可使硫苷全部分离;流动相流速为1.0 mL·min-1。
表1 脱硫硫代葡萄糖苷的HPLC梯度洗脱条件
以苯甲基硫苷为内标,根据保留时间和峰面积对花椰菜硫苷组分进行定量测定。利用内标和响应因子计算硫苷含量,单位为 μmol·g-1(FW)。
从表2可以看出,15个花椰菜品种中均检测到9种硫苷,分别为:3-甲基硫氧烯丙基硫苷(Glucoiberin,IBE)、2-羟基-3-丁烯基硫苷(Progoitrin,PRO)、2-丙 烯 基 硫 苷(Sinigrin,SIN)、4-甲基硫氧丁基硫苷(Glucoraphanin,RAA)、3-丁烯基硫苷(Gluconapin,NAP)、4-羟基吲哚基-3-甲基硫苷(4-Hydroxyglucobrassicin,4OH)、3-甲 基 吲 哚 基 硫 苷(Glucobrassicin,GBC)、4-甲 氧 基 吲 哚 基-3-甲 基 硫 苷(4-Methoxyglucobrassicin,4ME)、1-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷(Neoglucobrassicin,NEO),前5种属于脂肪族硫苷,后4种属于吲哚族硫苷〔根据侧链R基团的不同,硫苷可以分为脂肪族、吲哚族和芳香族3类(Mithen,2001)〕。
15个花椰菜品种的吲哚族硫苷总含量均比脂肪族硫苷总含量高,分别占总硫苷含量的84.49%和15.51%。其中,NEO含量最高,占总硫苷含量的42.61%;其次是GBC,占总硫苷含量的35.02%;RAA和4OH含量较低,仅占总硫苷含量的0.14%和0.05%。说明花椰菜中所含的硫苷以吲哚族为主,其中NEO和GBC是最主要的2种硫苷组分。
表2 不同花椰菜品种的硫苷组分及含量 μmol·g-1(FW)
图1显示,15个花椰菜品种的总硫苷含量存在较大差异,含量最高的是紫花1号,为4.872 8 μmol·g-1(FW);最低的是城场 120,仅为 0.332 3 μmol·g-1(FW);前者是后者的14.7倍。总硫苷含量较高的品种还有紫花4号、紫花2号、京松75、京松 85,分别为 2.533 2、2.422 1、1.968 7、 1.966 7 μmol·g-1(FW);总硫苷含量较低的品种有庆农 80〔0.488 9 μmol·g-1(FW)〕和津品 70 〔0.561 5 μmol·g-1(FW)〕。
图1 不同花椰菜品种的总硫苷含量
按松花菜、紧花菜和紫花菜3个类型进行分析,紫花菜的总硫苷含量最高,松花菜其次,紧花菜相对偏低,总硫苷含量范围分别为0.947 1~ 4.872 8 μmol·g-1(FW)、0.488 9~1.968 7 μmol·g-1(FW)和0.332 3~0.688 7 μmol·g-1(FW)。
图2显示,15个花椰菜品种的脂肪族硫苷总含量存在较大差异,变异范围在0.077 0~0.637 2 μmol·g-1(FW)之间。其中含量较高的是紫花菜类型的紫花1号、紫花3号、紫花4号,以及松花菜类型的京松 85,分别为 0.637 2、0.421 0、0.345 0、 0.312 0 μmol·g-1(FW);含量较低的是紧花菜类型的改良雪球、城场120、津品70,分别为0.077 0、0.078 0、0.096 0 μmol·g-1(FW)。
图2 不同花椰菜品种的脂肪族硫苷含量
在5种脂肪族硫苷中,IBE含量明显高于其他4种,占脂肪族硫苷总含量的58.20%;RAA含量最低,仅占脂肪族硫苷总含量的0.93%(表2)。
图3显示,15个花椰菜品种的吲哚族硫苷总含量也存在较大差异,变异范围在0.254 3~4.235 6 μmol·g-1(FW)之间。其中含量较高的是紫花菜类型的紫花1号、紫花4号、紫花2号,以及松花菜类型的京松 75、京松 85,分别为 4.236 5、2.188 2、 2.147 1、1.773 7、1.654 7 μmol·g-1(FW); 含 量较低的是紧花菜类型的城场120和松花菜类型的庆农 80,分别为 0.254 3、0.376 9 μmol·g-1(FW)。
图3 不同花椰菜品种的吲哚族硫苷含量
在4种吲哚族硫苷中,NEO和GBC含量较高,分别占吲哚族硫苷总含量的50.44%和41.45%;而4OH含量极低,仅占吲哚族硫苷总含量的 0.06%(表 2)。
松花菜、紧花菜和紫花菜是目前生产和市场上最流行的3类花椰菜,本试验针对这3类花椰菜进行了硫苷组分及含量的测定与分析,结果发现花椰菜中检测到的硫苷种类与甘蓝相同,均为5种脂肪族硫苷IBE、PRO、SIN、RAA、NAP和4种吲哚族硫苷4OH、GBC、4ME、NEO;但主要硫苷组分与甘蓝不完全相同,花椰菜中最主要的2种硫苷成分是NEO和GBC,而甘蓝中的硫苷以IBE、SIN和GBC为主要成分(胡丽萍 等,2015)。同为甘蓝类蔬菜,青花菜中的硫苷以RAA、GBC和NEO为主(丁云花 等,2015),芥蓝中的硫苷以NAP、GBC和NEO为主(司雨 等,2009)。说明在十字花科芸薹属甘蓝种的不同变种间,硫苷的主要成分和含量存在差异;但在已报道的不同种类的甘蓝类蔬菜中,GBC都是主要的硫苷成分。GBC是一种有益硫苷,其水解可以产生3-吲哚甲醇,它可以提高生物体苯酮还原酶的水平,诱导细胞凋亡,以抑制多种肿瘤细胞增殖(Weng et al.,2008)。
在不同类型的花椰菜之间,无论是脂肪族硫苷还是吲哚族硫苷,多数紫花菜类型的含量明显高于松花菜和紧花菜这两类白色花椰菜,说明紫花菜是花椰菜中的高硫苷资源,这在以往的文献中尚未见报道。在不同品种之间,3类花椰菜的总硫苷含量都存在较大的变异,紫花菜〔0.947 1~ 4.872 8 μmol·g-1(FW)〕 和 松 花 菜〔0.488 9~ 1.968 7 μmol·g-1(FW)〕的变异范围大于紧花菜〔0.332 3~0.688 7 μmol·g-1(FW)〕,这可能是由于紧花菜栽培历史长,长期的人工选择导致其遗传变异范围变窄。这个规律是否存在,还有待于扩大群体样本量后进一步研究证实。但从本试验结果来看,紧花菜类型的总硫苷含量普遍较低,而松花菜中有相对较高含量的品种,可以初步推断在松花菜中或许有高硫苷含量的资源,这点值得引起花椰菜育种工作者的注意。
总硫苷含量的高含量对于低含量为显性。法国学者Molice认为春油菜Bronowski的低硫苷含量是受3对隐性基因控制的,对于不同种类的硫苷的分离比例则相当复杂;Kondra和Stefansson认为3个位点控制的葡萄糖苷高含量对于低含量为部分显性,被4个或5个位点控制的芸薹葡萄糖苷高含量对于低含量为超显性,被4个位点控制的甲状腺素高含量对于低含量为部分显性;控制3种主要硫苷的基因系统不是彼此独立的(傅廷栋,1982;刘后利,1985)。因此,硫苷含量主要是由加性基因控制的,可以通过遗传基因重组的育种手段改良某个品种的总硫苷含量或者培育高硫苷含量的品种。由于环境条件对硫苷含量有一定的影响,因而进行遗传选择时必须注意环境条件的一致性。
硫苷虽然具有防癌、抗癌、抗氧化等多种对人类身体健康有益的功能,但其种类多,不是所有硫苷都对人体有益,如PRO是致甲状腺肿素5-乙烯唑烷 -2- 硫酮的前体(Heaney & Fenwick,1995)。所以,从营养健康角度,希望蔬菜中含有的有益硫苷含量越高越好;从育种角度,应该把提高某个品种的有益硫苷含量作为努力目标。在芸薹属蔬菜中,目前已被证实的有益硫苷有RAA、4OH、GBC、4ME、NEO等,本试验结果显示花椰菜中硫苷的主要成分是两种有益硫苷NEO和GBC。因此,通过搜集、挖掘、利用花椰菜中富含硫苷的种质资源,有望培育出更富抗癌活性物质、更具保健价值的花椰菜品种。
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