马铃薯卷叶病毒CP基因水溶性原核表达的研究

牛倩雅 辛 佳 王晶珊 杨 煜 李广存 郭宝太*

（1青岛农业大学生命科学学院，山东青岛 266109；2山东省农业科学院蔬菜花卉研究所，山东济南 250100）

马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus，PLRV）是黄症病毒科（Luteoviridae）成员，可引起马铃薯叶片纵向卷曲等症状，导致减产，引起品种退化，危害非常严重。马铃薯病毒粒体提取、纯化困难，PLRV的分布局限于寄主植株的维管束内，含量低，提取纯化尤其困难。我国自主研制的PLRV抗血清缺乏，远远不能满足其研究与脱毒种苗生产中对PLRV进行ELISA检测的需求。

PLRV-CP基因长度为627 bp，在我国6种马铃薯主要病毒中，其CP基因是最小的，但该基因密码子组成特别，原核表达非常困难，是利用原核表达重组CP制备PLRV特异性抗血清的障碍。PLRV-CP基因原核表达的困难可通过不同的技术 途 径 克 服（Lopez et al．，1994；Pichova et al．，2011）。青岛农业大学遗传研究室通过删除抑制翻译的126 bp片段，实现了其突变基因的高效原核表达，并利用重组CP制备出了PLRV抗血清（隋炯明 等，2012），且获得的抗体与酶标抗体可用于PLRV的DAS-ELISA检测（李楠楠 等，2011），为大量组装PLRV的ELISA试剂盒奠定了技术基础。

与病毒粒体作抗原相比，重组CP途径具有抗原制备效率高、纯度高，没有病毒扩散的潜在危害等优点。目前大多采用变性的重组蛋白作抗原制备马铃薯病毒抗血清，变性蛋白不具有天然的构象，与病毒粒体的抗原决定簇会存在差异。本试验目的是建立PLRV-CP基因水溶性原核表达体系，为利用水溶性重组CP制备出检测能力更强的PLRV抗血清奠定基础。

1 材料与方法

1.1 载体与菌株

分子伴侣原核表达质粒、冷激诱导原核表达载体pColdⅠ与pMD18-T克隆载体购自宝生物工程（大连）有限公司。PLRV-CP突变基因的原核表达载体pBAD-LRCP-126由本实验室构建（隋炯明 等，2012），简写为pBAD-LRCP，该基因受PBAD启动子驱动表达。大肠杆菌菌株DH5α、BL21（DE3）、TOP10由本实验室保存。

1.2 试剂与试剂盒

DNA marker、限制性内切酶、TaqDNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶等购自宝生物工程（大连）有限公司，质粒DNA小量提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。溶菌酶、蛋白酶抑制剂PMSF购自Sigma公司。

1.3 PCR引物

PLRV-CP基因的扩增引物P1的序列为：5´-CATATGAGTACGGTCGTGG -3´（含NdeⅠ酶切位点）；P2：5´-AAGCTTTTTGGGGTTTTGCAA-3´（含Hind Ⅲ酶切位点），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 利用分子伴侣增强PLRV-CP基因的水溶性表达

分别用5种可表达出分子伴侣的质粒（表1）转化重组菌TOP10（pBAD-LRCP），获得既含pBAD-LRCP又含分子伴侣原核表达载体的转化子。

将5种转化子分别在37 ℃，Amp终浓度100 μg·mL-1，Cm终浓度50 μg·mL-1的液体LB培养基中振荡培养，在OD600值达到0.6～0.9时，加入合适的诱导物使PLRV-CP基因与分子伴侣基因同时表达。

表1 用于转化的质粒及其表达的分子伴侣

1.5 利用冷激蛋白启动子增强PLRV-CP基因的水溶性表达

以pBAD-LRCP为模版，用引物P1、P2进行PCR扩增，电泳后回收含PLRV-CP基因的条带并与pMD18-T载体连接，连接产物转化DH5α，经酶切鉴定与测序筛选出目的克隆，其重组质粒命名为pMD18-LRCP。

pColdⅠDNA经NdeⅠ和Hind Ⅲ双酶切后回收大小约为4 000 bp的大片段，pMD18-LRCP质粒经同样的双酶切后回收500 bp的小片段，两个片段的连接产物转化BL21感受态细胞，通过酶切鉴定与测序确认表达载体的正确性，并命名为pCold-LRCP。

将重组菌BL21（pCold-LRCP）接种于液体LB培养基（Amp 浓度 100 μg·mL-1）中，37 ℃振荡培养过夜，按1∶100将过夜培养物接种于新鲜的LB培养基中，37 ℃振荡培养约3 h，OD600的值达到0.4～0.5，吸出1 mL菌液作为未诱导的对照，剩余菌液中加入IPTG至终浓度为0.1 mmol·L-1，15 ℃振荡培养24 h，诱导目的蛋白的表达。

1.6 测序

PLRV-CP基因亚克隆及原核表达载体构建中，测序分别采用针对pMD18-T与pColdⅠ的载体引物进行，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.7 菌体蛋白的提取与SDS-PAGE分析

菌体蛋白的提取采用溶菌酶法，取40 μL提取的上清蛋白加入10 μL 5×上样缓冲液混匀；未经诱导的菌体及提取的包涵体用1×蛋白上样缓冲液悬浮；上述样品煮沸离心后，各取20 μL上清点样，用12%的SDS-PAGE分析水溶性表达效果。

2 结果与分析

2.1 分子伴侣与PLRV-CP基因的水溶性表达

限制性酶切结果显示，质粒pG-KJE8中无NdeⅠ的切点（图1，泳道1～3），pBAD-LRCP中有预期NdeⅠ的单切点（图1，泳道6～7），pGKJE8转化TOP10（pBAD-LRCP）获得的单菌落中既有质粒pBAD-LRCP，也有pG-KJE8（图1，泳道4～5），是符合要求的转化子，命名为LR-1。用另外4种质粒转化，均获得了抗Amp与Cm的转化子（LR-2～LR-5）。

图1 转化子LR-1的酶切鉴定

前期的研究表明，表达载体pBAD-LRCP中，PLRV-CP基因5′端有铁氧还蛋白基因的片段，采用了融合表达的策略，但表达出的水溶性重组蛋白极少。本试验用转化子LR-1提取总蛋白，SDSPAGE分析显示，上清中有一条34 kD的特异性水溶性蛋白质条带（图2，泳道2），但重组蛋白主要以包涵体形式存在（图2，泳道3）。转化子LR-2诱导出的水溶性目的蛋白条带很明显（图3，泳道3），其水溶性的表达水平与LR-1相当，另外3种转化子中水溶性重组蛋白的表达量低于LR-1与LR-2。表明分子伴侣的存在使水相中的PLRV重组CP蛋白的量有明显提高，但没有期望的多。

图2 转化子LR-1中PLRV-CP基因的表达

图3 转化子LR-2中PLRV-CP基因的表达

2.2 冷激蛋白启动子与 PLRV-CP基因的水溶性表达

对PLRV-CP基因进行了T-A亚克隆，测序结果表明5′与3′分别含NdeⅠ切点、Hind Ⅲ切点的PLRV-CP基因序列已插入T载体中，该重组质粒命名为pMD18-LRCP。

pMD18-LRCP与pColdⅠ经NdeⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，回收相应的片段连接，酶切结果表明，PLRV-CP基因序列已插入表达载体中（图4），测序结果显示PLRV-CP基因的冷激诱导原核表达载体构建正确，命名为pCold-LRCP。图5是该表达载体pCold-LRCP的图谱，PLRV-CP基因长度为498 bp，处于cspA基因启动子下游，其表达产物的分子量约为20 kD。

重组菌BL21（pCold-LRCP）经低温诱导，SDS-PAGE检测表明在20 kD处有一条明显的特异性蛋白条带（图6，泳道2～4），其分子量符合预期，水溶性蛋白中该条带清晰（图6，泳道2～3）。表明冷激蛋白启动子可以增强PLRV-CP基因的水溶原核表达量，且效果好于分子伴侣。

图4 重组质粒pCold-LRCP的酶切图谱

图5 pCold-LRCP质粒图谱

图6 PLRV-CP基因的冷激诱导表达

3 结论与讨论

本试验比较了提高PLRV-CP基因水溶性表达效果的两种途径。首先，用5种表达分子伴侣的质粒转化重组菌TOP10（pBAD-LRCP），均可获得PLRV-CP基因水溶性表达水平提高的转化子，转化子LR-1与LR-2中PLRV重组CP的水溶性表达量较高，另外3种转化子的表达量低。其次，利用pColdⅠ构建出了PLRV-CP基因的原核表达载体，在冷激蛋白基因cspA的启动驱动下，该基因的水溶性表达水平明显提高，且水溶性重组CP表达量高于分子伴侣途径。第二种途径更适合于PLRV水溶性重组CP及其抗血清的大量制备。

大肠杆菌分子伴侣具有协助蛋白质正确折叠，形成天然构象的作用，它可增进原核表达重组蛋白的水溶性（崔硕硕 等，2011；许鹏 等，2012）。本试验中转化子LR-1表达出的伴侣蛋白是DnaKDnaJ-GrpE和GroES-GroEL两组分子伴侣蛋白，LR-2表达出的伴侣蛋白是GroES-GroEL，但两种转化子的水溶性重组蛋白表达量接近。即使在分子伴侣存在的情况下，PLRV重组CP仍然以包涵体形式为主，水溶性表达量较低。亓振国等（2011）研究发现原核表达中，GroES与GroEL具有抑制玉米西罗叶绿三酸:铁螯合酶在菌体内聚集的作用，但DnaK及DnaJ没有这种作用。针对一个具体的基因，分子伴侣对其水溶性原核表达的作用很难预测，需要通过试验确认。

冷激蛋白启动子可实现低温条件下目的基因的原核表达，也具有增强重组蛋白水溶性表达量的作用（屠小菊 等，2010；杜庆辉 等，2012）。本试验表明在冷激诱导启动子驱动下，水溶性PLRV重组CP的带型清晰，在总蛋白中占的比例也明显高于分子伴侣途径。扩大菌液培养与诱导体系，并将提取的上清蛋白液浓缩后，可通过镍离子亲和层析纯化出足量PLRV水溶性CP，满足制备PLRV抗血清之需。同时有必要进一步优化表达体系，提高其表达量，从而提高纯化效率与纯化量。

Raikhy等（2007）利用水溶性重组CP蛋白制备出了香石竹蚀环病毒（CERV）抗血清，表明纯化抗体（IgG）及其酶标抗体可用于CERV的DASELISA检测，效果达到了商品试剂盒的检测水平。马铃薯重组CP抗血清的报道中，均采用了纯化后的变性蛋白作抗原，未见利用水溶性重组蛋白作抗原的研究；用水溶性重组CP作抗原具有制备出高质量马铃薯病毒抗血清的潜力，是一个值得深入研究的新领域。

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