链霉菌JD211发酵条件优化

黄国强　李红　吴姚平　李庆蒙　韩顺　魏赛金

摘要：以戊二酰亚胺类抗生素菌株链霉菌（Streptomyces）JD211为研究对象，研究其发酵培养基和发酵条件，得出最佳培养基组成是甘油30 g/L、酵母膏10 g/L、硫酸铵5 g/L、NaCl 5 g/L、CaCO3 3.5 g/L。优化后的发酵条件为装液量50 mL/250 mL，初始pH 7.0，接种量7.5%，培养温度30 ℃，培养时间为144 h。培养基优化后菌丝体干重较优化前提高了166.61%，抑菌圈提高了30.77%。

关键词：链霉菌（Streptomyces）JD211；发酵培养基；发酵条件；优化

中图分类号：S476+.11 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2470-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.044

链霉菌（Streptomyces）JD211菌株是江西农业大学生物科学与工程学院从江西庐山珙桐树中分离筛选得到。研究发现，该菌株的粗提代谢物对水稻纹枯病菌、西瓜枯萎病菌等多种植物病原真菌具有显著的抑制效果[1]。其次生代谢物主要为戊二酰亚胺类抗生素，具有研发成新型友好生物农药的潜力和价值。本研究对链霉菌JD211培养基和培养条件进行初步研究，以此了解该菌适宜的发酵环境，提高抑菌活性物质的产量。

1 材料与方法

1.1 材料

链霉菌JD211、意大利青霉由江西农业大学生物工程实训基地提供。

蔗糖马铃薯培养基（PDA）：蔗糖20 g，去皮马铃薯200 g，琼脂20.0 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0。

种子培养基：葡萄糖10.0 g，甘油20.0 g，酵母膏10.0 g，碳酸钙5.0 g，硫酸铵5.0 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

PDB培养基：去皮土豆200 g，蔗糖20 g，去离子水1 000 mL，pH自然。

高氏一号培养基：可溶性淀粉 20 g，KNO3 1 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，去离子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

LB培养基[2]：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0。

察氏培养基：蔗糖30 g，NaNO3 2 g，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，去离子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

葡萄糖-天门冬酰胺液体培养基：葡萄糖10.0 g，天门冬酰胺0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，去离子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

Bennett′s培养基：葡萄糖10.0 g，N-Z酪蛋白素2 g，牛肉膏1 g，酵母粉1 g，去离子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

黄豆饼粉培养基：玉米淀粉20 g，玉米粉20 g，蔗糖20 g，黄豆饼粉15 g，KNO3 5 g，蛋白胨5 g，KH2PO4 0.3 g，NaCl 3 g，CaCO3 5 g，豆油10 mL，去离子水1 000 mL，pH 8.0。

甘油培养基：甘油30 g，牛肉膏10 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，CaCO3 3.5 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 种子液制备 将菌株JD211接种于PDA培养基上，于30 ℃恒温培养7 d后，将孢子洗下，调整孢子浓度为1×108 CFU/mL，即为种子液。

1.2.2 初始发酵培养基的筛选 分别选取PDB培养基、高氏一号培养基、LB培养基、察氏培养基、葡萄糖-天门冬酰胺培养基、Bennetts培养基、黄豆饼粉培养基、甘油培养基作为发酵培养基。确定链霉菌JD211发酵的初始培养基。初始发酵培养条件为：50 mL/250 mL的装液量，10%接种量，30 ℃160 r/min培养7 d。每个处理重复3次。

1.2.3 碳源筛选 分别以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、甘油替换初始培养基中的碳源，以不接链霉菌JD211但含有不同碳源的培养液为对照。接种量10%，30 ℃，180 r/min培养7 d，每个处理重复3次。

1.2.4 氮源筛选 分别以硫酸铵、硝酸钾、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素替换初始培养基中的氮源，以不接链霉菌JD211但含有不同氮源的培养液为对照，发酵条件同碳源筛选。

1.2.5 培养条件的筛选 设置不同时间（12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192 h）、不同温度（22、26、30、34、38 ℃）、不同装液量（30、40、50、60、70 mL）、不同接种量（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%）等条件下培养后，测定发酵液菌体干重和抑菌活性。每个处理重复3次。

1.2.6 优化结果的验证 对优化后的培养基和培养条件与初始培养基和培养条件相比较，对试验结果进行验证。

1.2.7 菌体干重和抑菌活性的测定 将每种发酵液4 000 r/min离心15 min，采用菌丝干重法测定菌体的生长量。发酵上清液用0.45 μm滤膜过滤除菌。除菌后，以意大利青霉为敏感指示菌，采用滤纸法[3]测定发酵液的抑菌圈，以抑菌圈直径的大小表示发酵液的抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 初始发酵培养基筛选结果

不同培养基的链霉菌JD211发酵液的菌丝体干重和抑菌活性见图1。由图1可知，链霉菌JD211在甘油培养基中发酵时对意大利青霉的抑菌活性最大，抑菌圈直径为10.4 mm，菌体干重为5.96 mg/mL。综合菌丝体干重和抑菌圈大小，选取甘油培养基作为初始培养基进行下一步优化。

2.2 碳源、氮源筛选结果

碳源、氮源筛选结果见图2。由图2可知，供试的6种碳源中，以甘油作为碳源时，JD211菌株的菌体干重和抑菌圈均最大，分别为5.67 mg/mL、10.5 mm。蔗糖和可溶性淀粉的抑菌圈大小相同，都为10.3 mm，麦芽糖的抑菌圈最小，只有9.5 mm。因此，确定甘油为JD211菌株发酵的碳源。分别用不同的氮源替代甘油培养基中的氮源发酵时，酵母膏是最有利于菌株JD211生长的氮源，菌体干重为13.23 mg/mL，但硫酸铵作为氮源时，发酵液抑菌活性最高，抑菌圈直径为11.7 mm。为了进一步提高菌株的抑菌活性，选取硫酸铵和酵母膏同时作为氮源。

2.3 发酵时间和温度的确定

发酵时间、培养温度对抑菌效果的影响见图3。由图3可知，抑菌活性在144 h抑菌活性达到最大值，抑菌圈直径为13.5 mm。菌体干重在30 ℃时达到最大值，抑菌活性最高，抑菌圈直径为13.4 mm，这跟菌体生长存在一定的关系。综合菌体干重和抑菌活性，在后续发酵中选取培养温度为30 ℃，发酵终止时间为144 h。

2.4 装液量和接种量的确定

摇瓶装液量、接种量对抑菌效果的影响见图4。由图4可知，菌丝体干重随装液量的增加逐渐下降，从40 mL到60 mL时下降最为明显。装液量为30 mL时抑菌活性最差，装液量为30 mL至50 mL时，抑菌活性逐渐升高。抑菌活性在50 mL到70 mL时逐渐下降，说明当装液量过多时，溶氧减少，不利于菌株JD211的次级代谢活动。因此，选取装液量为50 mL/250 mL。随着接种量的增加，菌丝体干重呈现出先上升后下降的趋势，在接种量为5%时菌丝体干重最大。之后随着接种量的增大，菌丝体干重反而减少。抑菌活性也是随着接种量的增加，呈现先上升后下降的趋势。接种量为7.5%时抑菌活性最大，抑菌圈直径为13.1 mm，说明在接种量为7.5%时能获得较好的活性产物，因此，选取接种量为7.5%。

2.5 验证试验结果

取确定碳源为30 g/L甘油、氮源为10g/L、酵母膏5 g/L硫酸铵的最适培养基，装液量为50 mL/250 mL，初始pH 7.0，接种量为7.5%，在30 ℃，160 r/m条件下发酵培养144 h。以初始培养基为对照分别测定优化前和优化后的菌体干重和抑菌活性。结果表明，进行培养基和培养条件优化后，菌丝体干重和抑菌活性均有了显著提高。其中菌丝体干重提高了166.61%，抑菌圈大小提高了30.77%。

3 小结与讨论

本研究通过培养基种类筛选、碳氮源筛选，确定了JD211菌株的培养基和培养条件。优化后发酵培养基的组成为甘油30 g/L、酵母膏10 g/L、硫氨酸5 g/L、NaCl 5 g/L、CaCO3 3.5 g/L。优化后的发酵条件为：装液量50 mL/250 mL，初始pH 7.0，接种量7.5%，培养温度30 ℃，培养时间为144 h。培养基优化后菌丝体干重较优化前提高了166.61%，抑菌圈大小提高了30.77%。

微生物的发酵受外部环境条件的影响较大，不同的环境条件往往使得微生物具有不同的生长状态和不同的代谢途径，从而产生出不同的代谢产物[4]。通过对抗生素发酵培养基和培养条件的优化，充分发挥菌种的生产潜力，从而进一步提高发酵单位[5]。本研究初步得到了适合菌株JD211生长和活性物质产生的培养基和培养条件。但是，这并不一定是最佳的培养基和培养条件。因此，菌株JD211的产活性物质合成能力还有待于进一步提高。

参考文献：

[1] 李庆蒙，王世强，李昆太，等.拮抗放线菌JD211的抑菌活性及其鉴定[J].生物灾害科学，2013，36（4）：394-398.

[2] 张 薇.烟草青枯菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及发酵条件研究[D].山东泰安：山东农业大学，2009.

[3] 张 佳，王 莹，张 峰，等.滤纸片法测定黄花蒿提取物对霉菌的抑制活性[J].湖北农业科学，2009，48（5）：1153-1154.

[4] 刘琴英，蒋冬花，齐育平，等.淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1菌株产生抗菌物质的发酵条件优化[J].生物技术通报，2014（1）：166-170.

[5] 骆健美.纳他霉素高产菌株选育、发酵条件优化、发酵动力学及溶解度的研究[D].杭州：浙江大学，2005.