超声波辅助提取分离菠菜色素的工艺研究

黄飞，屈飞强，任晓琼

（黄山学院化学化工学院，黄山 245041）

菠菜又称为赤根菜、鹦鹉菜和波斯草，含有丰富的蛋白质、碳水化合物、维生素A、B、C、磷、铁和钙等营养素物质[1]，还含有叶绿素、胡萝卜素和叶黄素等多种天然色素[2]，对人体具有较好的生理学作用。叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂，主要以叶绿素a 和叶绿素b 两种形式存在，叶绿素及其钠盐具有杀菌、除臭、解热、止血等功能，被广泛应用于食品、医药卫生和日用化学工业[3]。胡萝卜素具有三种异构体，其中β-胡萝卜素除具有维生素A 的生理活性外，还具有抗氧化作用，清除体内自由基，提高人体免疫力，延缓细胞和机体的衰老，广泛应用于食品、医药、化妆品及饲料添加剂等方面[4]。叶黄素是一种类胡萝卜素，是天然的食品色素和食品营养剂，具有抗氧化、抗衰老和抗突变等生物活性[5]。我国菠菜资源丰富，营养价值高，具有较大的开发利用价值。采用超声波辅助提取方法[6-11]对菠菜色素进行提取，通过单因素实验和正交试验研究了提取剂、料液比、提取温度、超声波功率和超声波时间对提取效果的影响，并利用柱层析法对菠菜色素进行分离。

1 实验部分

1.1 主要仪器

KQ-400KDE 型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；UV-2100 紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；RE-52AA 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；层析柱（30×2 cm）。

1.2 原料和试剂

市售菠菜；95%乙醇，无水乙醇，丙酮，氢氧化钠，石油醚（60～90 ℃）等均为分析纯；柱层析使用200～300 目柱层析硅胶（青岛海洋化工厂生产）。

2 实验方法

准确称取一定量新鲜干净切碎的菠菜叶，置入洁净干燥的锥形瓶中，在锥形瓶中加入一定量和一定浓度的提取剂，使之混合均匀后，把锥形瓶置于超声波清洗器的浴槽中，一定温度下进行超声波震荡提取一定时间。用循环水式真空泵将超声震荡后混合溶液进行固液分离，收集提取液，取0.5 mL 提取液用提取剂稀释定容到25 mL，用紫外可见分光光度计测其λmax=430 nm 处吸光度A，根据下列公式计算菠菜色素的产率[12]。

C（mg·mL-1）=菠菜色素吸光度A430/吸收系数

菠菜色素的产率= [C（mg·mL-1）×提取液总量（mL）]/ 样品鲜重（g）

将提取液用旋转蒸发仪进行浓缩，根据胡萝卜素、叶黄素、叶绿素极性不同，用柱层析法分离菠菜色素。向层析柱内加入高度为1～2 cm、体积比为10∶1的石油醚-丙酮混合液作为洗脱剂，打开玻璃阀让洗脱剂逐滴流出，当第1 个有色成分滴出时，取一洁净锥形瓶收集，得橙黄色溶液为β-胡萝卜素。将体积比为5∶1 的石油醚-丙酮混合液作为洗脱剂，继续洗脱可得到第2 个色带的棕黄色溶液为叶黄素。再将体积比为2∶1 的石油醚-丙酮混合液作为洗脱剂，可以依次得到叶绿素a（蓝绿色）和叶绿素b（黄绿色）[13-15]，最终实现β-胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a 和叶绿素b 的分离。

3 结果与讨论

3.1 单因素实验

3.1.1 提取剂对提取菠菜色素的影响

称取3.0 g 新鲜干净的菠菜叶分别置于30 mL的水、0.1%NaOH、5%NaOH、丙酮、95%乙醇、混合液A（乙醇：石油醚=3∶2，体积比）、混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，体积比）中，在室温条件下，用超声波清洗器处理30 min。取0.5 mL 提取液，用95%乙醇稀释定容到25 mL，用紫外可见分光光度计测其λmax=430 nm 处吸光度A，计算菠菜色素的产率，实验结果如表1 所示。

表1 不同提取剂对提取效果的影响Table 1 Effects of different extracting reagent on extraction result

由表1 可知，不同的提取剂其提取效果差异较大，混合液要比单一溶剂的提取效果好，混合液从菠菜叶片中直接提取色素效率明显提高，这是一种协萃现象[16]。根据实验结果，选择混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，体积比）为提取剂时，提取液的吸光度最大，菠菜色素的产率最高，因此选择混合液B 为提取剂效果较好。

3.1.2 料液比对提取菠菜色素的影响

称取3.0 g 新鲜干净的菠菜叶于锥形瓶中，分别加入9、12 、15 、18、21 mL 的混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，体积比），在室温条件下，用超声波清洗器处理30 min。取提取液0.5 mL，用混合液B 稀释定容到25 mL，用紫外可见分光光度计测其λmax=430 nm 处吸光度A，计算菠菜色素的产率，实验结果如表2 所示。

表2 液料比对提取效果的影响Table 2 Effects of the ratio of material to fluid on extraction result

由表2 可知，不同的料液比对提取效果有明显 的影响。在提取过程中，当包容固体的溶液的溶质浓度和浸出液溶质浓度相等时，提取达到平衡[3]。当料液比较小时，菠菜色素浸出液的吸光度较小，产率较低，当料液比为1∶5 时，吸光度达到最大，菠菜色素的产率最高。随料液比的增加，菠菜色素的产率反而减小，因此选择料液比为1∶5 时提取效果较好。

3.1.3 提取温度对提取菠菜色素的影响

称取3.0 g 新鲜干净菠菜叶于锥形瓶中，加入15 mL 混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，体积比），保持料液比为1∶5（g·mL-1），分别在30 ℃，40 ℃，50 ℃，60 ℃，70 ℃下，用超声波清洗器处理30 min 后，取提取液0.5 mL，用混合液B 稀释定容到25 mL，用紫外可见分光光度计测其λmax=430 nm 处吸光度A，计算菠菜色素的产率，实验结果如表3 所示。

表3 提取温度对提取效果的影响Table 3 Effects of extraction temperature on extraction result

由表3 可知，不同的提取温度对提取效果有明显的影响。当提取温度较低时，菠菜色素浸出液的吸光度较小，产率较低，当提取温度为50℃时，吸光度达到最大，菠菜色素产率最高。随提取温度的增加，菠菜色素的产率反而减小。这是因为在提取过程中，随着提取温度的增加，菠菜色素分子扩散速度加快，提取剂能更好地溶进其分子中，使其提取效果更好，菠菜色素浸出液的吸光度增加，产率也增加；当提取温度达到一定时，提取剂在菠菜色素分子中达到饱和，不能继续溶进其分子中，菠菜色素浸出液吸光度减小，产率降低，因此选择提取温度为50 ℃提取效果较好。

3.1.4 超声波时间对提取菠菜色素的影响

称取3.0 g 新鲜干净菠菜叶于锥形瓶中，加入15 mL 混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，体积比），保持料液比为1∶5（g·mL-1），温度为50 ℃，用超声波清洗器分别处理15、30、45、60、75 min。取提取液0.5 mL，用混合液B 稀释定容到25 mL，用紫外可见分光光度计测其λmax=430 nm 处吸光度A，计算菠菜色素的产率，实验结果如表4 所示。

表4 超声波时间对提取效果的影响Table 4 Effects of ultrasonic extraction time on extraction result

由表4 可知，随着超声波时间的增加，菠菜色素浸出液吸光度逐渐增加，产率也逐渐升高，当超声波时间为60 min 时，菠菜色素浸出液吸光度减小，产率降低。其原因可能是在超声波辐射的过程中，超声波能量直接传递到菠菜叶的内部，使之瞬时加热，温度急剧上升。超声辐射时间越长，温度越高，而菠菜色素对热的稳定性不好，所以导致菠菜色素的吸光度减小[3]，产率降低。因此选择超声波时间为60 min 提取效果较好。

3.1.5 超声波功率对提取菠菜色素的影响

称取3.0 g 新鲜干净菠菜叶于锥形瓶中，加入15 mL 混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，体积比），保持料液比为1∶5（g·mL-1），温度为50 ℃，用超声波清洗器经过功率分别为120 W、160 W、200 W、240 W、280 W的超声波处理60 min 后，取提取液0.5 mL，用混合液B 稀释定容到25 mL，用紫外可见分光光度计测其λmax=430 nm 处吸光度A，计算菠菜色素的产率，实验结果如表5 所示。

表5 超声波功率对提取效果的影响Table 5 Effects of ultrasonic power on extraction result

由表5 可知，随着超声波功率的增加，菠菜色素 浸出液吸光度不断增加，产率逐渐升高。当超声波功率为240 W 时，菠菜色素浸出液吸光度达到最大，菠菜色素的产率最高。随着超声波功率的继续增加，吸光度反而减小，产率降低。这是因为随着超声功率的增加，超声的空化作用、机械剪切的搅拌作用随之加强，菠菜细胞充分破裂[8]。当超声波功率过大时，可能会引起局部溶液瞬时升温过热，对菠菜色素的结构产生影响，使菠菜色素的构象发生改变[6]，从而影响菠菜色素的提取效果。

3.2 正交试验设计

3.2.1 正交试验影响因素的选择

根据单因素实验结果，提取剂、料液比、提取温度、超声波提取时间和超声波功率均会影响菠菜色素的提取，因此选取这五个因素同时作为考察因素，其实验的影响因素和水平见表6。

表6 正交试验因素和水平表Table 6 Factor-level of orthogonal experiment

3.2.2 正交实验结果与讨论

为了提高菠菜色素的产率，考察各实验因素对提取菠菜色素的影响，进行了5 因素4 水平L16（45）正交试验。其正交试验设计及结果见表7。

表7 L16（45）正交试验表及结果Table 7 Results of orthogonal experimen L16（45）

表7 中的R 为各因素的极差值，极差值的大小反映了实验因素对提取菠菜色素产率的影响。由极差分析结果可以看出，以提取菠菜色素产率为考察指标，5 种因素对提取菠菜色素产率的影响程度大小顺序依次为：提取剂（A）＞料液比（B）＞提取温度（C）＞超声波功率（E）＞超声波时间（D）；因此菠菜色素的最佳提取条件为：A4B2C3E4D1，即以乙醇与丙酮混合液（体积比为1∶1）为提取剂，料液比为1∶5（g·mL-1），提取温度为50 ℃，超声波时间为30 min，超声波功率为280 W，菠菜色素的提取效果最好，其产率为0.187 mg·g-1。

4 结论

（1）利用超声波辅助法提取菠菜中的色素，通过单因素实验和正交试验考察了提取剂、料液比、提取温度、超声波时间和超声波功率对提取效果的影响，得到了提取菠菜色素工艺的最优条件。实验结果表明，以乙醇与丙酮混合液（体积比为1∶1）为提取剂，料液比为1∶5（g·mL-1），提取温度为50 ℃，超声波时间为30 min，超声波功率为280 W，菠菜色素的提取效果最好，其产率为0.187 mg·g-1。超声波辅助提取法具有提取速度快、产率高、节约能源、绿色环保等优点，在天然色素的提取中具有广阔的应用前景。

（2）根据胡萝卜素、叶黄素、叶绿素极性不同，以不同体积比的石油醚-丙酮混合液作为洗脱剂，用层析柱法分离了菠菜色素，既能达到很好的分离效果，又能循环利用溶剂。

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