大鼠睾丸扭转损伤后白藜芦醇对损伤睾丸的保护和修复的研究

蔡国梅张华锋. 山东省潍坊医学院附属益都中心医院肾内科（青州 262500）；2. 山东省青州市人民医院泌尿外科

大鼠睾丸扭转损伤后白藜芦醇对损伤睾丸的保护和修复的研究

蔡国梅1张华锋2*
1. 山东省潍坊医学院附属益都中心医院肾内科（青州 262500）；2. 山东省青州市人民医院泌尿外科

摘要目的 探讨不同白藜芦醇（resveratrol，Res）剂量对大鼠睾丸扭转损伤复位后的超氧化物歧化酶（SOD），过氧化物酶（CAT），丙二醛（MDA），白介素-6（IL-6）及睾丸脑红蛋白 （neuroglobin, NGB）的影响。方法 60只成年雄性SD大鼠随机分为扭转复位组为A组；白藜芦醇低剂量（25mg/kg）为B组；白藜芦醇高剂量（50mg/kg）为C组；对照组为（D）组。按Turner法建立单侧睾丸扭转模型。每组根据设定处理方式的不同分别进行处理。扭转复位术后48h，采集左侧睾丸并进行指标（SOD、CAT、MDA及IL-6含量）检测；采用原位缺口末端标记（TUNEL）检测细胞凋亡指数（AI）；HE染色及Johnsen评分评估睾丸组织病理改变；电镜观察睾丸组织内生精小管及生精细胞超微改变；RT-PCR法检测睾丸组织中NGB mRNA的表达情况。结果 睾丸扭转损伤后，MDA为（2.890±6.51）mg/ L，IL-6为（31.221±7.02）μg/ L 明显升高，SOD为（240.985±8.19）mg/ L，CAT为（1.006 ±0.31）mg/ L及NGB mRNA为（0.35±0.01）明显减少，睾丸组织细胞大量凋亡。应用白藜芦醇后能改善上述改变，且随剂量增大，炎症改变明显减轻；脑红蛋白基因表达量明显增高，其中A组；B组；C组；D组NGB mRNA含量分别为0.35±0.01; 0.42±0.13; 0.81±0.19; 0.55±0.41，且组间两两比较均有统计学意义（P＜0.05）。结论 白藜芦醇对大鼠睾丸扭转具有保护作用，随剂量增中，其保护作用更加显著，同时具有提高抗氧化酶系统的抗氧化及降低血清炎症因子能力，其机制可能是通过诱导NGB mRNA表达而实现。

关键词精索扭转; 白藜芦醇

睾丸扭转多见于青少年和新生儿期，是导致睾丸疾病的急腹症之一，新生儿期睾丸扭转发生率为/7 500[1]。研究表明睾丸扭转如果未及时复位时，将导致睾丸的生精上皮细胞凋亡，睾丸生精细胞及发育表达相关蛋白受到破坏，严重导致不育[2, 3]。睾丸扭转后引起组织细胞形态学及免疫功能改变，同时生精细胞受损，细胞基因转录及合成障碍。白藜芦醇（resveratrol, Res）具有天然的抗炎、抗氧化剂免疫调节功能，改善组织微环境，以往研究表明[4, 5]其在缺血疾病时有保护作用。本实验通过建立睾丸扭转模型，探讨不同剂量白藜芦醇对大鼠睾丸扭转后睾丸脑红蛋白基因（NGB mRNA）表达情况及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（CAT）、丙二醛（MDA）、白介素-6（IL-6）的影响和可能发病机制。

资料与方法

一、药物与试剂

白藜芦醇粉剂（陕西慧科生物有限公司）；细胞凋亡检测（TUNEL）试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；和 PCR 试剂盒（购自Fermentas公司）；丙二醛、超氧化物岐化酶、过氧化物酶及白介素-6测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

二、实验动物分组

60只清洁健康成年雄性大鼠，体重280g～350g，由潍坊医学院实验动物中心提供，随机分为扭转复位组为A组；白藜芦醇低剂量（25mg/kg）为B组；白藜芦醇高剂量（50mg/kg）为C组；对照组为D组，每组5只。

三、模型制作方法

睾丸扭转模型的建立采用Turner法[6]戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，下腹正中小切口，游离左侧睾丸，切除睾丸引带，分离周围筋膜至附睾头，所有标本根据实验设计要求分为4组。扭转复位组（A组）：左侧阴囊切开后，绕精索顺时针扭转睾丸720°，肉膜白膜缝合固定防止自发复位，阴囊缝合，2h后，再次切开左侧阴囊，将扭转的睾丸复位固定，缝合阴囊。白藜芦醇低剂量（B组）：在A组的基础上于复位前20min，通过阴茎背静脉注射白藜芦醇（25mg/kg）；白藜芦醇高剂量（C组）：在A组的基础上于复位前20min，通过阴茎背静脉注射白藜芦醇（50mg/kg）；对照组（D组）：正常大鼠，体质量为280g～350g。游离暴露睾丸，但不予扭转，阴囊缝合关闭。术后均标准食谱喂养，48h后取扭转睾丸，分别制作组织匀浆和石蜡切片。

四、检测指标

（一）SOD、CAT、MDA和 IL-6含量检测

取各组睾丸组织0.3g，用匀浆介质制成15%的组织匀浆，光法检测CAT活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，酶联免疫法测定IL-6血清含量，操作均严格按说明书进行。

（二）睾丸细胞凋亡率（AI）检测

应用原位缺口末端标记(TUNEL)法，按照试剂盒说明书进行操作。每张切片均在高倍镜（400倍）视野下随机选取5个视野，计数凋亡细胞数目及总细胞数目。以5个视野的平均值代表每只大鼠睾丸组织细胞的凋亡率。

（三）标本的病理学观察

取睾丸组织，以40g/L多聚甲醛固定24h后作常规石蜡切片，HE染色观察睾丸组织的病理改变，电镜观察睾丸组织内生精小管及生精细胞超微改变。采用Johnsen评分判断睾丸病理损伤程度[7]。

（四） RT-PCR法检测各组睾丸组织NGB mRNA表达情况

PCR扩增引物（NGB mRNA）序列：上游引物序列为:5'-GGGCTCCTCCTGTCACCTTAC-3'，下游引物5'-TCCCACTCTATTTGCTCTCGC-3'（reverse）；内参GAPDH引物序列，上游引物5'-GCCAAGGTC ATCCATGACAACTTTGG-3'，下游引物5'-GCCTG CTTCACCACCTTCTTGATGTC-3'，收集各组睾丸组织，提取组织中总RNA，参照Revert Aid TM First Strand Cdna Synthesis说明书，进行逆转录反应，操作严格按照试剂盒说明要求进行。所得数据分析均由FTC-2000分析软件自动进行，所得靶基因相对含量=2-（Ct靶基因-CtGAPDH）X103，其中GAPDH为内参照。

五、统计学处理

运用SPSS13.0统计软件进行数据分析。采用t检验，以P＜0.05为有统计学意义。

结 果

一、睾丸组织中SOD、CATT、MMDDAA和 IL-6含量的变化

各组睾丸中SOD、CAT、MDA和 IL-6含量的变化结果显示：睾丸扭转组MDA和 IL-6含量明显高于其他3组，SOD、CAT含量低于其他三组，组间比较均有统计学意义（P＜0.05）；药物白藜芦醇后MDA 和 IL-6含量有所降低，其中以高剂量为主，药物组与其他组比较有统计学意义；低剂量组与高剂量组比较有统计学意义（P＜0.05），说明白藜芦醇能减轻扭转睾丸组织的炎症反应程度，并以高剂量白藜芦醇C组为著，见表1。

二、各组睾丸组织细胞凋亡原位检测

扭转复位组（A组）大鼠睾丸生精细胞排列紊乱，生精细胞脱落明显、胞浆浓缩，生殖细胞凋亡阳性细胞数量明显增加。在对照组（D组）睾丸生精上皮未见凋亡细胞。白藜芦醇药物组生精细胞脱落及生殖细胞凋亡率明降低，且随白藜芦醇药物剂量的增加，凋亡率降低程度更为明显，以C组为著，与扭转复位组及对照组比较，均有统计学意义（P＜0.05）表2。

三、大鼠睾丸组织的病理改变

扭转复位组（A组）（图1A1A）睾丸生精上皮严重损伤，仅见有少量精母细胞，呈唯Sertoli细胞表现，间质重度水肿、充血，可见有大量中性粒细胞。白藜芦醇低剂量（B组）（图1B1B）可见生精上皮脱落，精子数量减少，组织中度充血、水肿。白藜芦醇高剂量（C组）（图1C1C）生精上皮未见明显紊乱，可见大量精子，间质轻度水肿，见少量中性粒细胞。对照组（D组）（图1D1D）睾丸生精上皮结构正常，未见明显损伤。白藜芦醇高剂量C组Johnsen评分与其他组Johnsen评分比较明显高，见表2。

表1 各组大鼠睾丸组织中CAT、 SOD 、MDA、IL-6含量变化

表2 各组大鼠睾丸组织细胞凋亡率（AIAI）及Johnsenhnsen评分比较

图1 大鼠睾丸组织的病理改变（HE×400）

四、各组大鼠睾丸组织超微结构变化

电镜下扭转组（A组）（图2A2A）精原细胞核膜不规整，未进入分裂前状态，细胞间隙见大小不等的脂滴。对照组（D组）（图2D2D）睾丸内见正常形态的精子细胞，且精子发生正常。白藜芦醇药物组大鼠睾丸内精子细胞核圆，胞质内线粒体丰富，尾部线粒体较均匀，脂滴减少明显，微管结构及赤道板渐变清晰，以高剂量C组为著（图2B2B, 图2C2C）。

图2 大鼠睾丸组织超微改变

五、RT-PCRT-PCR法检测睾丸组织中NGB mRNA mRNA的表达变化

各组睾丸组织扭转组及药物组，NGB mRNA （287bp）相应片段大小的位置出现条带，NGB mRNA的条带强度均比内参GAPDH条带的强度明显要弱，与A组条带相比，其他各组条带明显增强，其C组亮度明显强于D组， A组；B组；C组；D组表达含量分别（0. 35±0.01; 0. 42±0.13; 0. 81±0.19; 0.55± 0.41）两组间比较有统计学意义（P＜0.05），其中白藜芦醇药物后大鼠睾丸组织中NGB mRNA表达含量较明显上调,说明大鼠睾丸组织中NGB mRNA表达含量较扭转组明显升高，见图3。

图3 大鼠睾丸组织NGBmRNA含量表达情况

讨 论

睾丸扭转实质引起组织缺血缺氧性损伤，发生病理生理性改变，此过程引起睾丸生精上皮系统发生系列变化，释放大量细胞因子和其他炎症介质，最终引起生精细胞凋亡[8]。近年来研究发现，白藜芦醇是一类多酚类化合物，它具有抗氧化、抗炎，保护心脑血管、免疫调节作用，其在肠缺血缺氧损伤和、应激性胃溃疡中具有保护作用，提高抗氧化功能及抑制上皮细胞凋亡作用[9, 10]。本实验采用TUNEL法检测各组大鼠睾丸生精上皮细胞的凋亡情况，结果显示：扭转组睾丸细胞凋亡指数显著高于其他组，说明睾丸扭转损伤后使大鼠睾丸生精上皮凋亡明显增加，在大鼠睾丸扭转后，给予白藜芦醇治疗能减轻生精上皮细胞凋亡程度，同时显示随着其剂量增加，其抑制细胞凋亡程度明显增强，Johnsen评分也显著升高，表明白藜芦醇对睾丸扭转损伤后的生精细胞的保护可能与抑制细胞凋亡有关，且随剂量增加，其凋亡率降低程度更为明显。

研究表明脑红蛋白（neuroglobin, NGB）主要在脑缺血疾病及内分泌疾病中有保护作用，认为它可能通过携氧、贮氧和氧感受器功能，NADH 氧化酶作用，以及ROS 和NO基团清道夫等功能，对缺血缺氧性损伤起到改善或保护作用[11-13]。正常情况下机体氧自由基的产生、利用和清除之间处于一种动态平衡。但在睾丸缺血再损伤中，使睾丸处于氧化应激状态，氧自由基急剧增多，氧自由基对细胞膜的损伤可引起生物膜及脂质过氧化反应，结合了炎症介质的释放，最终导致MDA及 IL-6含量增加，组织细胞损伤，生精细胞凋亡明显。

本研究通过建立大鼠睾丸扭转模型后，进一步探讨了白藜芦醇对大鼠扭转后NGB mRNA基因表达及SOD、CAT、MDA及IL-6的表达特点，应用白藜芦醇药物后结果显示，抗氧化酶SOD、CAT活性明显高于扭转组，MDA、IL-6含量明显低于扭转组，两组间比较均有明显统计学意义（P＜0.05）。睾丸扭转后抗氧化酶系统已遭破坏，从而启动了凋亡程序。观察了组织病理及形态学改变，扭转复位组，被膜血管扩张明显，大量中性粒细胞浸润，曲细精管结构紊乱、变性坏死增多，此与文献报道基本一致[14, 15]。本研究应用白藜芦醇后睾丸生精小管结构较为完整，生精细胞层次稍有紊乱，尾部线粒体较均匀，脂滴减少明显，微管结构及赤道板渐变清晰，以高剂量C组为著。电镜下扭转组可见大量脂滴和精原细胞核膜不规整现象，应用白藜芦醇后脂滴减少明显，且可见精子细胞核膜规整、核圆、胞质内线粒体。RTPCR检测发现，应用白藜芦醇后大鼠睾丸组织中NGB mRNA基因表达条带亮度明显增强，说明白藜芦醇提高睾丸组织中脑红蛋白基因（NGB mRNA）表达含量，高剂量白藜芦醇组NGB mRNA含量最高，提示可能在睾丸扭转后抗缺氧缺血损伤方面有一定的积极意义。

总之，本研究应用白藜芦醇后大鼠睾丸组织SOD、CAT活性明显增高， MDA、IL-6含量明显下降，睾丸脑红蛋白 （neuroglobin，NGB）含量表达明显增强，以高剂量组为最显著。当然本研究存在缺陷和不足，如无对睾丸扭转复位的不同时间寻找不可逆损伤关键时间点，并给予白藜芦醇干预治疗。目前Res对睾丸扭转后NGB mRNA表达与抗氧化酶系统的因果关系尚未明确，本研究显示大鼠单侧睾丸扭转后, 应用白藜芦醇对睾丸组织功能具有改善或保护作用，同时提高了抗氧化酶系统的抗氧化能力以及降低了血清炎症因子能力，推测可能是通过诱导NGB mRNA基因表达而实现，但如何诱导及调控等问题有待搜集大量样本进一步深入研究探讨。

参 考 文 献

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（2014-12-05收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.03.006

中图分类号R 697.24

*通讯作者, E-mail : zhanghuafeng09@126.com

Proctective effects and repair discussion of resveratrol on testicular torsion in rats

Cai Guomei1, Zhang Huafeng2*
1. Department of Renal Medicine , Yidu Central Hospital, Affi liated to Weifang Medical School, Qingzhou 262500, China; 2. Department of Urology Surgery, Qingzhou People's Hospital
Corresponding author: Zhang Huafeng, E-mail : zhanghuafeng09@126.com

AbstractObjective To analyze the expression profi les of SOD, CAT, MDA, IL-6, neuroglobin in testis tissues of rat testicular torsion under resveratrol intervention, and explore its protective effecton. Methodsthods Sixty SD rats were randomly divided into four groups including the torsion (A) group, low dose resveratrol (25mg/kg B) group, high dose resveratrol (50mg/kg C) group and sham(D) group.After 48 hours treatment, the rats were killed and their left testis were collecetd and the levels of superoxide dismutase(SOD),the activity of catalase(CAT) and level of malonic Diethylaldehyde (MDA), interleukin-6(IL-6) were detected; Germ cell apoptosis index(AI) was measured by TUNEL; The histological changes were observed by hight microscope and Johnsen score. The NGB mRNA expression was detected by reversetranscription PCR. Resultssults For the rats in torsion injury group, the cells apoptosis and MDA[ (2.890±6.51) mg/ L], IL-6 [ (31.221±7.02) μg/ L] levels were remarkably increased, and SOD[ (240.985±8.19) mg/ L], CAT[ (1.006±0.31) mg/ L] andNGB mRNA (0.35±0.01) levels were decreased. For the rats in the resveratrol treatment group, the relief of infl ammatory degree and increase of NGB mRNA had a positve correlation with the concentration of resveratrol.The express of NGB had signifi cant difference among these four groups(groupA 0.35±0.01,group B 0.42±0.13,group C 0.81±0.19, group D 0.55±0.41, the difference is signifi cant in each two groups, P＜0.05). Conclusionusion Resveratrol has protective effect on testis in adult rats testieulus torsion and reduce the germ cell apoptosis and repress the generation of oxygen-derived free radicals.This effect may be achieved through an induced expression of NGB mRNA.

Key wordsords spermatic cord torsion; resveratrol