龟龄集胶囊对弱精子症精子线粒体功能的作用机制研究

孙中明吴燕红 周海港 姜语彦 许哲杰嵊泗县人民医院泌尿科（浙江嵊泗 202450）

龟龄集胶囊对弱精子症精子线粒体功能的作用机制研究

孙中明*吴燕红 周海港 姜语彦 许哲杰
嵊泗县人民医院泌尿科（浙江嵊泗 202450）

摘要目的 观察龟龄集胶囊对特发性弱精子症精子线粒体的作用，探讨龟龄集胶囊治疗特发性弱精子症的机制。方法 根据特发性弱精子症诊断标准，筛选特发性弱精子症且中医辨证属肾阳虚的患者253例为治疗组，根据前向运动（A级+B级）精子的百分率分成3组：35%≤A组＜50%、20%≤B组＜35%、C组＜20%；选取61名正常生育男性为空白对照组。A、B、C组均用龟龄集胶囊治疗，每次0.6 g，每日2次，4个月为一个疗程。对各组精子治疗前后均作精子线粒体功能检测和精液分析，并观察各组精子密度、精子活力、精子线粒体琥珀酸脱氢酶（SDH）、线粒体膜电位（MMP）治疗前后的变化。结果 （1）各组治疗后线粒体功能SDH、MMP改善，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（2）各组前向运动精子活力均有明显提高（P＜0.01）。结论 龟龄集胶囊能有效改善特发性弱精子症精子活力，其机制是改善精子线粒体琥珀酸脱氢酶和线粒体膜电位，从而提高了线粒体的功能。

关键词弱精子症; 琥珀酸脱氢酶; 膜电位,线粒体; 精子能动性; 龟龄集

特发性弱精子症是指患者通过男性不育相关常规检查及精液分析后发现除精子活力低下外，其他未发现影响男性生育的因素，而且也找不到明确的精子活力低下的病因。患者临床上也无明显症状和体征[1, 2]。目前特发性弱精子症的精子线粒体功能病变的原因及机制不明，中西医治疗上均缺乏针对性。我们在用龟龄集胶囊治疗中医辩证肾阳虚亏型特发性弱精子症时，发现其改善精子线粒体功能和活力方面有明显效果。

资料与方法

一、一般资料

选取2012年1月至2014年3月来我院就诊的特发性弱精子症患者253例作为治疗组，且中医辨证为肾阳虚损证型。根据（A级+B级）精子的百分率分成3组： 35%≤A组＜50%、20%≤B组＜35%、C组＜20%；其中A组80例，B组89例，C组84例。病程均在4～10年，各组平均年龄分别为A组（34.3±2.4）岁，B组（33.9±2.5）岁，C组（34.7±2.2）岁。各组在年龄、病程方面无统计学意义（P＞0.05）。选取1名已生育正常婴儿的男性且相关项目体检健康者作为空白对照组，平均年龄（33.1±2.5）岁。该组作精液分析和精子线粒体的功能检测，不服用药物。

二、诊断标准

不孕不育诊断参照《男性不育症诊断与治疗》[3]及《人类精子学》[4]：（1）正常育龄青年婚后1年或以上，性生活正常，未避孕，至今不育；（2）排除下列具有影响男性生殖的肯定病因：医源性因素、全身性病因、先天性异常、后天性睾丸损害、精索静脉曲张、男性附属性腺感染、血内分泌激素（生殖激素6项、甲状腺功能、皮质醇等）、染色体异常等；（3）精液分析精子密度≥20×106/mL而快速前向运动的精子A级＜25%和前向运动（A级＋B级）精子＜50%。

肾阳虚证诊断参照《实用中西医结合泌尿男科学》[5]、《实用中西医结合不孕不育诊疗学》[6]、《男科疾病中西医汇通》[7]、《肾阳虚证症状表现规律的临床研究》[8]和《对肾阳虚证诊断标准层次性的探讨》[9]：（1）夫妻婚后1年或以上，性生活正常，未避孕，女方未曾孕育；（2）精液分析用伟力精液分析系统连续分析两次以上，选择除精子活力、活率异常外，其他未发现异常的不育患者，从中选择A级精子＜25%和（A级＋B级）精子＜50%的患者。（3）肾阳虚证的诊断标准：腰酸膝软，畏寒肢冷，面色白，夜尿频多，小便清长，大便溏薄，兼有神疲乏力，头晕，形寒，性欲淡漠，四肢不温，腰痛，阳痿等证候中的2项。舌淡，舌胖边有齿痕，苔薄白。脉沉细，或脉弱，或迟无力。（4）特发性弱精子症患者找不到明确病因。

三、纳入及排除标准

（一）纳入标准

（1）符合诊断标准；（2）治疗前6个月内未使用针对该病症的中西药及其他治疗方法；（3）女方检查均正常。

（二）排除标准

（1）配偶有不孕疾患；（2）性生活不正常，逆行射精或不射精等；（3）服用抗癫痫病、抗肿瘤等有碍生精及精子活力的药物者；（4）男方生殖系统先天畸形，精路梗阻，睾丸萎缩，精索静脉曲张Ⅱ级以上患者；（5）对本药过敏者；（6）合并心血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病，精神病患者；（7）就诊半年内使用性激素等西药治疗或长期服用各类补肾中药达2个月以上者；（8）不符合纳入标准，未按规定用药，无法判断疗效或资料不全等影响疗效和安全性判断者。

四、方法与观察指标

（一）药物、试剂和仪器

线粒体膜电位检测试剂盒系美国Biomet公司产；FeSO4购自天津市福晨化学试剂厂；H2O2系美国Sigma公司产；MHTF（Modifi ed HTF Medium）购自美国OVEN公司；FACS Caliber型流式细胞仪系美国BD公司产；DMAR2型荧光显微镜系德国LEICA公司产；LDZ5-2离心机由北京医用离心机厂提供；电热恒温水浴锅系北京市医疗设备厂产。精液分析用伟力计算机辅助精液分析系统（WLJY-9000）并配备恒温装置。

（二）方法

精液分析根据WHO的标准，隔5d连续分析二次以上，除精子活力、活率异常外，选择其他未发现异常的不育患者533例。从中选择中医辩证肾阳虚的患者且A级精子＜25%和前向运动（A级＋B级）精子＜50% 的共计253例，因为精子活力与精子线粒体琥珀酸脱氢酶（SDH）、线粒体膜电位（MMP）密切相关，所以根据（A级＋B级）精子百分率以小于50%、35%、20%为界限，分成三组。正常对照组：选择婚后2年已正常生育过健康婴儿且无不良嗜好的男性，精液分析及相关项目检查正常的志愿者61例作为空白对照组。同时作精液分析和检测精子线粒体功能。用药方法：正常空白对照组不服用药物、A、B、C组均用龟龄集胶囊（山西广誉远国药有限公司，国药准字Z14020687，规格：0.3g×30粒）。0.6g，Bid。4个月为一个疗程，共二个疗程。治疗期间禁烟酒，生活规律。

（三）观察指标

（1）治疗前后均检测精子密度与A级精子活力。（2）精子线粒体琥珀酸脱氢酶（SDH）检测：采用NBT法并参照文献[10, 11]介绍的方法进行精子线粒体SDH检测。精子尾中段（线粒体所在部位）有蓝色颗粒沉着，即为精子SDH性，在高倍镜下观察10个视野，共计数100个精子，计算正常着色精子数量。生育男性正常着色线粒体精子＞70%。（3）精子线粒体膜电位（MMP）检测：参照文献[12-14]用荧光探针JC-1检测精子线粒体膜电位，荧光显微镜下JC-1染色的精子形态 精子尾中段部即线粒体所在部位着色明亮。精子对JC-1的摄取依赖于跨膜电位，线粒体膜电位低，呈现绿色荧光。正常精子的线粒体膜电位高，呈现红色荧光。正常呈现红色荧光线粒体精子＞70%。各组分别治疗4个月为1个疗程，对照组和治疗组均在治疗前后分别作精液分析、精子线粒体功能检测。

五、统计学分析

应用SPSS11.0统计软件分析，计量资料以x±s表示，用单因素方差检验。计数资料采用列联表资料的卡方（x2）检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、治疗前后各组精液分析比较

A、B、C组治疗前后比较精子密度差异有统计学意义（P＜0.01）。治疗后各组间精子密度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。A、B、C组治疗后前向运动（A级+B级）精子活力均提高，与治疗前比较差异有统计学意义（P＜0.01）。治疗后各组间前向运动精子活力比较： C组与正常组、A组、B组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。B组与正常组、A组差异比较有统计学意义（P＜0.01）。A组与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。龟龄集胶囊能有效改善特发性弱精子症前向运动（A级+B级）精子活力和密度，见表1。

表1 各组治疗前后精子相关参数的影响

二、治疗前后线粒体功能结果比较

各组治疗前随着精子活力的下降，线粒体正常着色精子数呈现出下降趋势（SDH、MMP的正常率下降）。治疗后线粒体正常着色精子数呈现上升趋势（SDH、MMP的正常率上升）。除正常组治疗前后线粒体功能的差别比较无统计学意义（P＞0.05）外，其他各组治疗前后线粒体功能差别的比较均有统计学意义（P＜0.01）。治疗后各组间比较：C组与A、B、正常组线粒体功能差别比较有统计学意义（P＜0.05）；A、B、正常组相互间线粒体功能差别比较无统计学意义（P＜0.05）。治疗后线粒体正常着色精子数（SDH、MMP的正常率）的上升，精子活力也随着上升，精子线粒体功能与精子活力成正相关，见表2。

表 2 各组精子线粒体功能比较（xx±ss,, %%）

讨 论

在弱精子症中有10.9%为特发性弱精子症[8]。精子动力低下的原因有：（1）外因：精子抗体阳性、解脲支原体阳性 、前列腺炎、血性激素异常等，这些均是外界存在影响精子动力的因素。（2）内因如：最常见的问题是精子尾超微动力装置结构性病变和功能发生异常，如线粒体病变：堆积、小线粒体、大线粒体、囊性化、融合、移位、缺损；轴丝病变：周围轴丝缺损、周围轴丝排列紊乱、中央轴丝排列紊乱等；致密纤维病变：左右排列紊乱、密纤维缺损等，这些均是精子本身内在动力系统病变。精液分析是分析精子运动的物理参数，不能表明精子运动障碍的原因。至于精子尾部结构的病变导致运动障碍首先需要作相关功能检测和超微检查，如线粒体功能检测和形态检查[10, 11]。

在弱精子症和死精子症中，可见大量线粒体缺陷的存在。琥珀酸脱氢酶（SDH）是线粒体标志酶之一，其活性的降低可影响精子能量代谢，造成精子运动能力下降。SDH可将琥珀酸氧化生成延胡索酸，脱下的H+通过中间氢受体吩嗪甲基硫酸酯（PMS）将硝基四氮唑蓝还原为二甲月替，呈蓝紫色颗粒[12]。

线粒体是精子运动能量提供的场所。其功能状况直接决定了精子的运动能力，特别是与受精密切相关的前向运动能力。线粒体是精子呼吸的主要场所。通过氧化磷酸化作用合成ATP，为精子的运动提供能量，而ATP合成过程与线粒体内的电子传递有关。线粒体通过电子传递将H+从基质泵至膜间隙，在线粒体内侧形成跨膜的线粒体膜电位，推动ATP合成酶合成TP供精子生命活动所需。线粒体膜电位的维持对于线粒体正常功能的实现极其重要，膜电位的下降会导致ATP合成不足，影响细胞正常的生命活动。线粒体膜电位反应了精子的能量代谢水平，线粒体膜电位的丧失可导致精子细胞凋亡与坏死。因此，通过检测线粒体膜电位的变化，有助于了解线粒体的功能变化[13]。

线粒体的功能状态对精子存活起着重要作用，因为精子的运动能力与线粒体的活性密切相关，整个精子代谢所需的能量主要由线粒体提供。线粒体活性的改变会影响精子的能量供应，且研究表明，线粒体还是细胞凋亡的调控中枢。因此，线粒体的功能状态是了解精子功能质量的一个关键性指标[14-18]。本文研究结果表明：随着治疗后线粒体SDH、MMP正常率的上升，精子活力也随着上升，精子线粒体功能与精子活力成正相关。线粒体的功能状态在中医属于肾阳、肾精、元阳范畴。如能补益线粒体的“阳气”则能提高精子活力。

中药龟龄集胶囊起源于明代。有方士邵元节据“云籍上筏”的增删而取名，方由人参、鹿茸、海马、枸杞子、丁香、穿山甲、雀脑、牛膝、锁阳、熟地黄、补骨脂、菟丝子、杜仲、石燕、肉苁蓉、甘草、天冬、淫羊藿、大青盐、砂仁等28味中药组成，能强身补脑，固肾补气，增进食欲。用于肾亏阳弱，记忆减退，夜梦精溢，腰酸腿软，气虚咳嗽，五更溏泻，食欲不振。中医学认为具有温肾助阳、大补真元的功效。多用于治疗命门火衰、肾精不足及气血亏损引起的阳痿及遗精[19]。能增强下丘脑-垂体-性腺轴及肾上腺皮质轴等内分泌系统的分泌功能，其提取液能影响“阳痿”模型小鼠DNA的合成，同时对体外精子的各种运动参数有明显促进作用。对活性氧所致的精子损伤有拮抗作用，促使腺体保持年轻水平，其中人参有大补元气和补脾肾的作用；增强性腺机能，有促进性腺激素作用，在细胞培养中细胞数明显增多，细胞生长旺盛寿命延长，其提取液能提高精子的运动速度。鹿茸可以温养督脉、生精益髓。锁阳、枸杞子、肉苁蓉、淫羊藿等有滋肾阴，补肾阳，阳中求阴、阴中求阳，益气强精的功效。砂仁宣通三焦气机，醒脾和胃，补后天以助先天，既免除补肾滋腻碍胃之弊，又可引诸药归肾，能收敛固涩、益气生津、补肾宁心[20-26]。精子发生的周期为3个月，由于中药的起效需要一个积累过程，所以该治疗4个月为一个疗程，共2个疗程，以充分有效发挥中药的作用。

上述研究发现龟龄集胶囊能有效改善精子尾线粒体SDH、MMP的正常率，正常着色精子数上升，精子活力也随着上升。其机制是改善线粒体功能相关病变引起的精子运动障碍导致的活力低下，从而起到补益线粒体“阳气”的作用。其具体的详细的作用步骤或机制环节还有待进一步研究。

参 考 文 献

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（2014-03-08收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.03.008

中图分类号R 698.2

*通讯作者, Tel: 18058069031; E-mail: 1104858603@qq.com

Study on Guilinji Capsule for mitochondria function of sperm in idiopathic asthenospermia

Sun Zhongming*, Wu Yanhong, Zou Hangang, Jiang Yuyan, XuZhejie
Zhejiang Shenshi Hospital, Shenshi 202450, Zhe Jiang, China
Corresponding author: Sun Zhongming, Tel: 18058069031; E-mail: 1104858603@qq.com

AbstractObjective To study the effect of Guilinji capsule on mitochondria function of sperm tail in idiopathic asthenospermia and explore its mechanism. Methodsthods According to the diagnosing standard of idiopathic asthenospermia and A and B level sperm viability, 253cases with idiopathic asthenospermia were divided into 3 groups, 35%≤A＜50%, 20%≤B＜35%, C＜20%, and treated with Guilinji capsule 0.6g, Bid. four months for one period of treatment. Seminal fl uid analysis and mitochondria function examination were carried out before and after treatment. Sperm density,viability,SDH and MMP were comparatively analzed. Resultssults There was a more significant improvement in mitochondria function (SDH、MMP) (P＜0.01)and sperm viability of each group after treatment (P＜0.01). Conclusionusion Guilinji capsule signifi cantly improvement in mitochondria function of sperm in idiopathic asthenospermia and level of sperm viability.

Key wordsords asthenozoospermia; succinate dehydrogenase; membrane potential, mitochondrial; sperm motility; Guilinji capsule