HnRNP LRNP L蛋白在人前列腺癌组织中的表达及其临床意义*

束方鹏周 佥吕道均雷 斌周许敏毛向明**. 南方医科大学南方医院泌尿外科（广东广州 5055）; . 江西省丰城市中医院

HnRNP LRNP L蛋白在人前列腺癌组织中的表达及其临床意义*

束方鹏1周 佥2吕道均1雷 斌1周许敏1毛向明1**
1. 南方医科大学南方医院泌尿外科（广东广州 510515）; 2. 江西省丰城市中医院

摘要目的 研究hnRNP L蛋白在前列腺癌中的表达及临床意义。方法 收集我院2011年1月至2013年5月期间行前列腺癌根治术后标本60例，良性前列腺增生（BPH）组织标本40例。采用Western blot及免疫组化法检测hnRNP L蛋白在前列腺癌及良性前列腺增生组织中的表达，并分析其表达与临床病理参数之间的关系。结果Western blot结果显示hnRNP L蛋白在前列腺癌组织中的表达明显高于良性前列腺增生组织（P＜0.05）。免疫组化结果表明hnRNP L蛋白阳性表达于细胞核，其在前列腺癌及前列腺增生组织中的阳性表达率分别为66.7%、17.5%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。此外，hnRNP L在前列腺癌组织中的表达与T分期、临床分期以及Gleason评分密切相关（P＜0.05）。结论 hnRNP L高表达于前列腺癌组织，与前列腺癌的发生发展存在相关关系，有可能作为前列腺癌早期诊断标志物和治疗靶点。

关键词前列腺肿瘤; 核不均一核糖核蛋白L; 免疫组织化学; 蛋白质印迹法

前列腺癌是威胁男性健康的最常见肿瘤之一，在发达国家其发病率居男性肿瘤首位，占全部恶性肿瘤的28%，其死亡率仅次于肺癌[1]。我国前列腺癌的发病率与死亡率虽远低于欧美国家，但近年来随着人口老龄化、环境污染和前列腺特异抗原（PSA）筛查的普及，其发病率呈快速上升趋势，已成为影响男性健康的主要因素[2]。据《北京市2011年健康白皮书》报道，北京市男性前列腺癌发病率由2001年的5.53/10万上升至2010年的16.62/10万，9年增长200.5%，年均增长9.2%。另一项针对全国前列腺癌流行病学研究表明：我国前列腺癌发病率呈明显持续增长趋势，50岁以上前列腺癌发病率显著增加[3]。前列腺癌的发病率和死亡率具有明显的种族差异，我国前列腺癌患者的最大特点是晚期患者多、治疗效果较差，究其原因，缺乏缜密的早期筛查、综合治疗不尽规范是关键[4]。由于前列腺癌发生存在十分明显的人种差异，研究中国人群特异性、个体化的前列腺癌发病机制，寻找有效的早期诊断和治疗的分子靶标具有重要意义。

目前，前列腺癌的发病机制仍不清楚。而越来越多的证据表明，RNA的选择性剪接作为一个广泛存在的生物进程，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。其中，核不均一核糖核蛋白家族（hnRNPs）因具有选择性剪接作用而在肿瘤发生中占据重要位置。核不均一核糖核蛋白L（HnRNP L）作为hnRNPs家族中的一员，近几年在肿瘤中的研究相继开展，但是hnRNP L在前列腺癌中的表达情况及其功能研究在国内外尚无公开报道。本实验通过研究hnRNP L在前列腺癌组织中的表达，探讨其与前列腺癌临床参数的相关性，为前列腺癌早期诊断、治疗提供新的理论依据。

材料与方法

一、组织标本

60例新鲜前列腺癌组织及40例前列腺增生组织取自南方医院2011年1月至2013年5月前列腺癌手术切除标本，均为前列腺腺泡腺癌，患者平均年龄67岁。全部标本根据2010版AJCC-TNM分期：T1期15例；T2期19例；T3期21例；T4期5例，根据 Gleason 评分系统，7分以下34例，8～10分26例。选取同期40例BPH标本作为对照，平均年龄63岁。所有标本均由两名资深病理医师诊断证实。取材后，一半组织立即置于液氮中保存，一半置于甲醛中固定。

二、主要试剂

抗人h n R N P L的鼠源单克隆抗体（P L laboratories)，抗人GAPDH的鼠源单克隆抗体（欣博盛生物科技有限公司），链素抗生物素-过氧化物酶（SP）免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（武汉博士德生物有限公司）。

三、实验方法

（一）Western blot

取40mg组织经液氮研磨后加入400 μl RIPA裂解液（50 mmol/LTris，150 mmol/LNaCl，1%TritonX-100，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，1mmol/ LPMSF），离心后吸取上清液。BCA法测定蛋白浓度后，用RIPA裂解液调整蛋白终浓度为5μg/μL。蛋白与上样缓冲液混匀经煮沸变性后，取10μl混合液在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE电泳，使用BIO-RAD公司的半干转印仪将蛋白转至PVDF膜上。半干法转膜条件为24V，200mA，30min。5%脱脂牛奶室温封闭2h，分别加入抗人hnRNP L的鼠源单克隆抗体（1:1000，3%BSA）或抗人GAPDH的鼠源单克隆抗体（1:2000，3% BSA）于4℃孵育过夜。次日，1XTBST漂洗3次，每次5min，再分别加入相应的二抗（1:5000，1% BSA）室温孵育1h。1XTBST漂洗3次，每次5min，使用ECL发光液进行化学发光。使用CareStreamHealth公司的Image Station4000R PRO成像仪检测发光信号。最后图像经“ImageJ2x”软件定量后，hnRNP L与GAPDH的灰度值比值用作hnRNP L蛋白表达水平的组间比较。

（二）免疫组化

10%福尔马林固定，石蜡包埋的组织块被切成2μm厚的石蜡切片，经常规脱蜡和水化后，在柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）煮沸2min进行抗原修复。依次滴加3% H2O2灭活内源性过氧化物酶（室温下孵育10min）、 正常山羊血清封闭（室温下孵育30min）、hnRNP L一抗（1:200，4℃过夜）、生物素标记的二抗（室温下孵育30min）、SP溶液（室温下孵育10min），最后滴加新鲜配制的DAB进行显色（5min）。显微镜下根据观察染色情况流水冲洗，终止显色。苏木素复染后进行脱水封片。染色表达评分方法根据染色强度和阳性细胞数比例两项指标进行综合评判。每张切片随机选取5个视野（400×）进行评分。染色强度分级评分为：无着色，0分；淡黄色，1分；棕黄色，2分：棕褐色，3分。阳性细胞数比例分级评分为：0%，0分；1%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；6%～100%，4分。染色评分=染色强度评分+阳性细胞数比例评分，总评分：（-）为0～2分；（+）为3分；（++）为4分；（+++）为5～7分。定义（-）、（+）为低表达，定义（++）、（+++）为高表达。所有切片均由两名病理医生进行双盲阅片。

四、统计分析

实验结果采用SPSS13.0统计学软件进行分析。采用配对t检验分析前列腺癌和BPH组织中hnRNP L蛋白的表达水平。样本率的比较采用x2检验，P＜0.05（双侧检验）为差异有统计学意义。

结 果

一、Western blot blot检测hnRNP LRNP L蛋白的表达水平

Western blot所得图像用“ImageJ2x”软件作灰度值分析，用hnRNP L与GAPDH灰度值的比值表示各样本中hnRNP L蛋白表达强度，计算出相对表达值。结果显示前列腺癌组织中hnRNP L蛋白的表达量为0.626±0.190，良性前列腺增生组织为0.255±0.100，两者比较，差异具有统计学意义（P=0.002，图1）。

图1 hnRNP L 蛋白在前列腺癌（C）和良性前列腺增生组织（N）中Western bblloott结果

二、免疫组化检测HnRNP LRNP L蛋白在前列腺癌及BPH组织中的表达

HnRNPL蛋白主要表达于细胞核内，呈弥漫性分布（见图2）。HnRNPL蛋白在前列腺癌组织中多数呈阳性表达，阳性表达率为66.7%（40/60）；在良性

PH组织中hnRNP L蛋白显色的阳性细胞数及显色强度较前列腺癌组织明显减少及降低，在少数良性BPH组织中呈阳性表达，阳性表达率为17.5%（7/40），两者比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

三、hnRNP LRNP L蛋白在前列腺癌中的表达与临床病理参数的关系

60例前列腺癌组织中，hnRNP L蛋白的表达与T分期、临床分期及Gleason评分密切相关；其中，T1-T4 期hnRNP L蛋白的阳性表达率分别为46.7 %（7/15）、2.6（10/19）、90.5%（19/20）及80.0%（4/5），组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。Gleason评分≤7分及8～10分的患者中，hnRNP L蛋白的阳性表达率分别为55.9%（19/34）、80.8%（21/26），组间比较差异有显著性（P＜0.05）。临床分期为Ⅱ期、Ⅲ期及IV期患者中，hnRNP L蛋白的阳性表达率分别为50.0%（16/32）、82.4%（14/17）、90.9（10/11），组间比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。然而，hnRNP L蛋白表达与患者年龄无明显相关性（表2）。

讨 论

HnRNP L为hnRNPs家族成员，参与染色体重塑、RNA稳定性调节、蛋白质翻译以及相关信号转导过程[5-7]。近年来研究表明hnRNP L表达与肿瘤的发生发展密切相关。其中，Yau等[8]研究表明hnRNP L 蛋白高表达于肝癌组织，其表达与肿瘤细胞的生长、迁移及侵袭相关。Goehet等[9]研究表明hnRNP L参与调控肺癌的成瘤能力。D'Agostino等[10]研究表明hnRNP L可能与乳腺癌的发生相关。然而，关于hnRNP L表达是否与前列腺癌的发生发展相关，目前尚缺乏相关研究报道。

图2 hnRNP L 蛋白在前列腺癌和良性前列腺增生组织中免疫组化染色结果

表1 hnRNP L 在前列腺癌和BBPPHH组织中的表达

表2 前列腺癌中hnRNP LRNP L的表达与相关临床病理特征的关系

本研究中，我们通过Western blot和免疫组化实验检测了hnRNP L在60例前列腺癌及40例良性前列腺增生组织中的表达，结果显示hnRNP L在前列腺癌中的表达明显高于前列腺增生，提示hnRNP L表达可能与前列腺癌的发生相关，hnRNP L高表达可能有助于前列腺癌的发生。进一步结合前列腺癌患者的临床病理资料，我们发现hnRNP L在前列腺癌中的表达与T分期相关，提示hnRNP L与肿瘤的大小相关，hnRNP L高表达可能有助于肿瘤细胞的增殖。同时，hnRNP L表达与临床分期及Gleason评分呈明显正相关，提示hnRNP L表达可能与前列腺癌患者的病情进展相关，影响患者的预后，这与hnRNP L在肝癌中的报道较为相符。

hnRNP L是一种RNA结合蛋白，参与染色体重塑、转录、翻译的调控以及信号转导等多个生物进程[11]，在肿瘤发生发展中的作用值得重视。关于hnRNP L在前列腺癌中的作用机制尚不清楚。目前研究已报道hnRNP L在其它肿瘤中的可能作用机制。其中，Goehet等[9]研究表明hnRNP L通过对caspase-9 Pre-RNA的加工，影响非小细胞肺癌的肿瘤形成。Lee等[12]发现在乳腺癌细胞中，hnRNP L与内源性Bcl-2 mRNA具有相互作用关系。Jafarifar等[13]发现hnRNP L可调控与肿瘤发生发展密切相关的血管内皮生长因子（VEGF-A）。近期有研究表明：hnRNP L 和lncRNA-THRIL可形成功能复合体并与TNFα启动子区域结合，通过调节Toll受体信号通路中的髓样分化因子MyD88，达到调控TNFα基因转录的作用[14]。HnRNP L已被证实参与细胞凋亡，RNA转运等生物进程，与肿瘤发生密切相关，然而关于hnRNP L在前列腺癌中的作用机制仍有待于后续的深入研究。

总之，本研究结果显示hnRNP L蛋白在前列腺癌组织中的表达显著高于良性前列腺增生组织，且其表达与前列腺癌的T分期、临床分期及Gleason评分密切相关，提示hnRNP L可能参与了前列腺癌的发生及发展过程，并有望成为临床前列腺癌早期诊断的标志物和治疗靶点。然而，关于hnRNP L在前列腺癌中的生物学功能及其作用机制，仍有待于后续的研究证实。

参 考 文 献

1 Siegel R, Ma J, Zou Z, et al. Cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin 2014; 64(1): 9-29

2 韩仁强, 武鸣, 陈万青, 等. 2003～2007 年中国前列腺癌发病与死亡分析. 中国肿瘤 2012; 21(11): 805-811

3 韩苏军, 张思维, 陈万青, 等. 中国前列腺癌发病现状和流行趋势分析. 临床肿瘤学杂志 2013; 18(4): 330-334

4 彭瑞鲜, 施国伟. 高危前列腺癌的治疗进展. 现代泌尿外科杂志 2015; 20(1): 63-67

5 Hui J, Stangl K, Lane WS, et al. HnRNP L stimulates splicing of the eNOS gene by binding to variable-length CA repeats. Nat Struct Biol 2003; 10(1): 33-37

6 Liu X, Mertz JE. HnRNP L binds a cis-acting RNA sequence element that enables intron-dependent gene expression. Genes Dev 1995; 9(14): 1766-1780

7 Guang S, Felthauser AM, Mertz JE. Binding of hnRNP L to the pre-mRNA processing enhancer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene enhances both polyadenylation and nucleocytoplasmic export of intronless mRNAs. Mol Cell Biol 2005; 25(15): 6303-6313

8 Yau WY, Shih HC, Tsai MH, et al. Autoantibody recognition of an N-terminal epitope of hnRNP L marks the risk for developing HBV-related hepatocellular carcinoma. J Proteomics 2013; 94: 346-358

9 Goehe RW, Shultz JC, Murudkar C, et al. hnRNP L regulates the tumorigenic capacity of lung cancer xenografts in mice via caspase-9 pre-mRNA processing. J Clin Invest 2010; 120(11): 3923-3939

10 D'Agostino L, Caracciolo V, Giordano A. NSP 5a3a's link to nuclear-cyto proteins B23 and hnRNP-L between normal and aberrant breast cell lines. Cell Cycle 2010; 9(6): 1131-1142

11 Han SP, Tang YH, Smith R. Functional diversity of the hnRNPs: past, present and perspectives. Biochem J 2010; 430(3): 379-392

12 Lee DH, Lim MH, Youn DY, et al. hnRNP L binds to CA repeats in the 3'UTR of bcl-2 mRNA. Biochem Biophys Res Commun 2009; 382(3): 583-587

13 Jafarifar F, Yao P, Eswarappa SM, et al. Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNP L. EMBO J 2011; 30(7): 1324-1334

14 Li Z, Chao TC, Chang KY, et al. The long noncoding RNA THRIL regulates TNFα expression through its interaction with hnRNPL. Proc Natl Acad Sci U S A 2014; 111(3): 1002-1007

（2014-12-20收稿）

**通讯作者, E-mail: 13691903635@126.com

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.03.003

中图分类号R 737.25

*基金项目资助: 广东省科技计划项目（项目编号：2013B021800147）；深圳市科技计划项目（项目编号：JCYJ20140415162542992）

Expression of hnRNP L protein in human prostate cancer tissues and its clinical signifi cance*

Shu Fangpeng, Zhou Qian2, Lv Daojun, Lei Bin, Zhou Xuming, Mao Xiangming**
1. Department of Urology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;
2. Traditional Chinese Medicine Hospital, Fengcheng, Jiangxi Province
Corresponding author: Mao Xiangming, E-mail: 13691903635@126.com

AbstractObjective To Investigate the expression of hnRNP L in human prostate cancer and explore its clinical signifi cance. Methodsthods Sixty cases of prostate cancer and 40 cases of benign prostate hyperplasias in our hospital during January, 2011 and May, 2013 were enrolled in this study. The expression of hnRNP L protein in prostate cancer tissues and benign prostate hyperplasias tissues was detected by Western blotting and immunohistochemistry (IHC), respectively. Meanwhile, the correlation between hnRNP L expression and clinical pathological characters was analyzed. Results ults Western blotting analysis showed that hnRNP L expression in prostate cancer tissues was signifi cantly higher than that in in benign prostate hyperplasias tissues (P＜0.05). IHC analysis demonstrated that positive expression of hnRNP L was located in nuclear of cells, and the positive rates of hnRNP L in prostate cancer and benign preostate hyperplasias were 66.7% and 17.5%, respectively, with a signifi cant difference (P＜0.05). Moreover, hnRNP L expression was positively correlated with T stage, clinical stage and Gleason score in prostate cancer (P＜0.05). Conclusionusion hnRNP L is highly expressed in prostate cancer tissues, and correlated with tumor occurrence and development, which may be served as effective molecular marker or therapeutic target in prostate cancer.

Key wordsords prostatic neoplasms; Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoprotein L; immunohistochemistry; Western Blotting