超重及肥胖男性不育患者精子早期凋亡研究*

白双勇王剑松**赵庆华. 昆明医科大学第二附属医院泌尿外科（昆明 650000）; . 昆明医科大学第二附属医院妇科

超重及肥胖男性不育患者精子早期凋亡研究*

白双勇1王剑松1**赵庆华2
1. 昆明医科大学第二附属医院泌尿外科（昆明 650000）; 2. 昆明医科大学第二附属医院妇科

摘要目的 为进一步了解超重及肥胖对男性生育力影响，探究男性不育患者精子早期凋亡发生情况及原因。方法 通过随机抽样抽取对照组26人；男性不育患者26人，其中超重不育组12人；肥胖不育组14人。入选对象完成精液常规及Annexin V-FITC/PI双染精子，流式细胞仪检测精子早期凋亡率，酶联免疫法ELISA检测精浆中活性氧、谷胱甘肽过氧化物酶检测。结果 精子早期凋亡率超重不育组（15.73±6.49）%与对照组（10.48±6.21）%相比，高于后者，差异有显著性（P＜0.05）。肥胖不育组（16.16±6.57）%与对照组相比，高于后者，差异有显著性（P＜0.05）。超重不育组和肥胖不育组相比，两者差异无显著性（P＞0.05）。体质指数与精子活动率负相关（R=-0.31，P＜0.05），与不动精子率呈正相关（R=0.31，P＜0.05），与精子早期凋亡率呈明显正相关（R=0.41，P＜0.01）。活性氧与精子早期凋亡率呈正相关（R=0.61，P＜0.01），谷胱甘肽过氧化物酶与精子早期凋亡率呈负相关（R=-0.46，P＜0.01）。结论 超重及肥胖男性不育患者精浆中活性氧水平增高，而谷胱甘肽过氧化物酶下降导致精子早期凋亡率增高，导致超重、肥胖影响男性不育原因之一。

关键词人体质量指数; 精子; 细胞凋亡; 不育, 男性

Key woorrddss body mass index; spermatozoa; apoptosis; infertility,male

随着发达国家肥胖率上升，肥胖与生育之间的相互作用也逐渐引起人们的重视。肥胖导致男性不育的机制有多方面，包括：促性腺激素、雄激素下降，雄激素和雌激素转化异常，胰岛素抵抗、睡眠障碍等[1]，肥胖男性精子数目减少，精子活力下降等[2]，成人精子凋亡对于调节精子生成是非常重要的机制，通过凋亡可以使本身异常的精子细胞不继续发展为成熟精子，可以避免将有遗传缺陷传递给下一代，如果凋亡率过高则导致其生育力下降。精浆中活性氧（reactive oxygen species，ROS）在低水平时可以调节精子生理功能包括：精子获能、顶体反应，线粒体鞘稳定性和精子的运动性。但是过量的ROS及其代谢产物可能损伤DNA、脂质、蛋白，改变酶系统，引起细胞凋亡增加。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，它能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。本次研究目的是探讨在超重及肥胖男性精子凋亡与精浆中ROS、GSH-Px 之间的关系，为临床超重、肥胖男性不育诊断及治疗提供一定基础。

材料和方法

一、一般资料

本研究获昆明医科大学第二附属医院伦理委员会同意，参与的患者都被告知相应的权利。2013年4月至10月在昆明医科大学第二附属医院生殖中心就诊人群中随机抽取男性。男性不育症标准为：有规律性生活未避孕一年而未使妻子受孕的男性。男性年龄最小不小于21岁，年龄最大不超过50岁。排除标准：与超重/肥胖无关的疾病或异常病史（包括：精索静脉曲张，隐睾症，肿瘤，男性绝育术，睾丸扭转）；严重附属性腺炎症；有生育毒性物接触史如农药厂工人；为进一步研究体质指数对男性生育力的影响，严重少弱精症和无精子症也排出。选取来门诊检查准备生育二胎正常体重男性26人为正常对照组，超重不育男性12人，肥胖不育男性14人。

二、方法

（一）精液分析

所有参与课题男性禁欲48～72h后，通过手淫办法获取精液，严格按照世界卫生组织2010年第五版人类精液检验与处理实验室手册要求，由昆明医科大学第二附属医院男科实验室工作人员按操作规程精液常规分析。

（二）分组

所有患者着轻便衣服，不穿鞋情况下测量身高和体重。身高为站立位足底到头部最高点垂直距离，单位m。体重为人体的总重量，单位kg。体重指数（body mass index, BMI）=体重（kg）/身高（m）2。根据中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会2013 年10月1日实施卫生行业标准，成人男性正常体重指数为24.00＞BMI≥18.5；超重为28.00＞BMI≥24.0；肥胖组为BMI≥28.0。

（三）制备单细胞悬液

调整细胞浓度为1×106/mL，1000×g ，离心5min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。 取5～10万重悬的细胞，1000×g离心5min，弃上清，使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购于嘉美纽诺（北京）生物科技有限公司。加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温（20～25℃）避光孵育10min。可以使用铝箔进行避光。1000×g离心5分钟，弃上清，加入190μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴且避光放置，避光孵育15min，1h内进行流式检测。

（四）流式细胞仪检测

激发光波长为488nm，用525nm的带通滤片检测FITC，用610nm的带通滤片检测PI。分别通过FITC和PI对数荧光直方图或散点图分析活细胞、凋亡细胞和坏死细胞百分率。对照设定：（1）单纯活细胞，不加AnnexinⅤ和PI；（2）活细胞只加AnnexinⅤ，不加PI；（3）活细胞只加PI，不加AnnexinⅤ；（4）已知凋亡的细胞系作为阳性对照；已知未凋亡的细胞系作为阴性对照。

（五）检测精浆中ROS、GSH-Px

经过精液常规分析检测后的精液标本经2000g离心25分钟获取精浆，行酶联免疫法ELISA（上海欣乐生物有限公司试剂盒）检测精浆中ROS、GSH-Px。

三、统计学分析

采用SPSS 19.0软件导入数据库进行数据分析,各组数据以（x±s）表示， 通过单因素ANOVA比较，LSD分析各组间差异。Person相关性分析检测各因素之间的相关性，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

表1中对照组、超重组、肥胖组在年龄，精液量、精子浓度、精子活动率、前向运动率、不动精子率、畸形率、精液中白细胞数等方面均无显著性差异（P＞0.05）。在精子早期凋亡率的比较中超重组（15.73±6.49）%与对照组（10.48±6.21）%相比，高于后者，差异有显著性（P＜0.05）。肥胖组（16.16±6.57）%与对照组相比较，高于后者，差异有显著性（P＜0.05）。超重组和肥胖组相比，两者差异无显著性（P＞0.05）。在精子晚期凋亡及坏死率的比较中对照组（18.52±10.85）%、超重不育组（19.20±13.16）%、肥胖不育组（18.67±9.01）%，3者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 超重、肥胖男性不育患者精液分析、早期凋亡及精浆中ROS、GSH-PxSH-Px比较（x±sxs）

精浆中ROS各组比较中超重组（576.13± 90.76）高于对照组（415.94±147.72），差异有显著性（P＜0.05）。肥胖组（1050.82±179.00）高于对照组，差异有显著性（P＜0.05）。肥胖组高于超重组，差异有显著性（P＜0.05）。精浆中GSH-Px各组比较中超重组（91.20±22.43）低于对照组（130.24± 7.11）, 差异有显著性（P＜0.05）。肥胖组（67.58± 6.12）低于对照组，差异有显著性（P＜0.05）。肥胖组低于超重组，差异有显著性（P＜0.05）。

表2中，年龄、体质指数、精浆中ROS、GSH-x与精液常规各项指标、精子早期凋亡率相关性分析中，年龄与精子各项指标、早期凋亡率之间无相关性。体质指数与精液分析中精子活动率负相关（R=-0.31，P＜0.05），与不动精子率呈正相关（R=0.31，P＜0.05），体质指数与精子早期凋亡率呈正相关（R=0.41，P＜0.01）。与精液其他各项指标无相关性。体质指数与精浆中活性氧呈正相关（R=0.77，P＜0.01），而与精浆中谷胱甘肽过氧化物酶呈负相关（R=-0.69，P＜0.01）。活性氧与精子早期凋亡率呈正相关（R=0.61，P＜0.01），谷胱甘肽过氧化物酶与精子早期凋亡率呈负相关（R=-0.46，P＜0.01）。

表2 年龄、BMIBMI、精浆中ROS、GSH-PxSH-Px与精液各项指标相关性分析

讨 论

肥胖影响男性生育机制可能主要在于改变男性激素内分泌以及精子遗传方式。目前有关肥胖与精子生成之间的研究多种，但是其结果常常不一致，Macdonald等[3]在其Meta分析中未发现BMI增加与精液各项指标改变有相关性。Eisenberg等[4]研究结果认为：随着BMI增加男性射精量减少，精子总数也与BMI呈负相关性，但是BMI与精子浓度、活动率、形态、精子DNA碎片指数无相关性。Sermondade 等[5]Meta分析结果认为在超重、肥胖男性发生少、弱精症的几率高于正常体重男性，两者之间存在J形关系。Shaha[6]研究认为超重和肥胖男性精子活动率及精子总数均低于正常BMI男性，精子活动率与BMI呈负相关性。而本次研究结果中，BMI与精子活动率呈负相关性，与精子不活动率呈正相关。本次研究结果与Sermondade等不尽相同，而与Shaha结果相似。

凋亡对于生殖细胞从其胚胎性腺分化早期阶段就有调节生殖细胞分化数目及功能的作用。成人精子凋亡后可以将有损伤的生殖细胞从曲细精管中清除，不再继续发展成为精子，保持遗传稳定[6]。一般在成人睾丸组织有25%～75%生殖细胞发生凋亡，精子发生自发凋亡在精子发生异常时起着重要调节和自我修复的作用。在细胞凋亡的早期阶段，细胞膜的脂质分布不对称性丧失，但胞膜结构仍然完整。位于细胞质膜内的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）转移到膜外, 此过程的发生一般早于细胞核的改变。Erdemir等[7]研究发现随着体重增加，肥胖雄性小鼠血清中活性氧增加，可能是导致雄性小鼠生育力下降原因之一。精液中ROS产生主要是来自白细胞和精子。过量产生的ROS可以损伤细胞和组织，由于精子细胞膜富含不饱和脂肪酸而细胞质内仅有少量酶可以中和ROS，很容易受到ROS的损伤。ROS导致精子细胞膜发生脂质过氧化可以诱发精子凋亡的发生增加，细胞膜脂质过氧化作用产生亲电子醛基可以降低精子运动能力。吕毅清等人研究发现[8]正常男性精子早期凋亡率为（3.52±1.88）%，在精索静脉曲张和白细胞精液组精子凋亡率均增加。Aitken[9]研究发现精子遭受氧化损伤的过程中，精子DNA修复缺乏体细胞DNA修复机制，通过内切酶切除受损碱基，从而修复损伤的DNA。由于精子DNA损伤后修复能力较差，则精子DNA受损后，精子早期凋亡增加。在精子生成的微环境中，有相应的抗氧化系统，包括酶系和非酶抗氧化成分，精液中的主要抗氧化酶系统被称为由超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶。精浆中GSH-Px来自前列腺，主要定位于线粒体基质中，参与精子染色质压缩和保护精子免于ROS的损害。当精浆中GSH-Px下降，则其抗氧化能力下降，则精子凋亡增加[10]。

在本次研究结果中发现，超重不育组及肥胖组精浆中ROS均高于对照组，差异有显著性。而且随着BMI增加，精浆中ROS水平上升，BMI与ROS之间呈正相关。与之相反超重不育组及肥胖不育组精浆中GSH-Px水平均低于对照组，差异有显著性，随BMI增加精浆中GSH-Px降低，BMI与GSH-Px之间呈负相关。在精子早期凋亡率的比较中，超重组与对照组相比，高于后者，差异有显著性。肥胖组与对照组相比较，高于后者，差异有显著性。超重组和肥胖组相比，两者差异无显著性。精子早期凋亡率与BMI及精浆中ROS呈正相关，而与精浆中GSH-Px呈负相关。结果显示，随着男性BMI增加，由于精浆中ROS增加，而精浆中GSH-Px降低，则诱发精子凋亡损害因素增加，而保护性因素降低，最终导致超重及肥胖男性不育患者精子早期凋亡率增加，精子早期凋亡率增高则精卵结合几率降低，男性生育力降低。可能是导致超重及肥胖男性不育患者生育力下降的原因之一。而临床治疗应该注重考虑纠正男性肥胖才能有效提高男性生育力。肥胖男性不育患者精子早期凋亡率增高其原因是多方面的，还需要进一步去研究。本次研究结果还需要扩大临床样本去证实，以及完善更深入的机制探究。

参 考 文 献

1 Hammoud AO, Meikle AW, Reis LO, et al. Obesity and male infertility: a practical approach. Semin Reprod Med 2012; 30(6):486-495

2 Sermondade N, Faure C, Fezeu L, et al. BMI in relation to sperm count: an updated systematic review and collaborative meta-analysis. Hum Reprod Update 2013; 19(3): 221-231

3 Macdonald AA, Stewart AW, Farquhar CM. Body mass index in relation to semen quality and reproductive hormones in New Zealand men: a cross-sectional study in fertility clinics. Hum Reprod 2013; 28(12): 3178-3187

4 Eisenberg ML, Kim S, Chen Z, et al. The relationship between male BMI and waist circumference on semen quality: data from the LIFE study.Hum Reprod 2014; 29(2): 193-200

5 Sermondade N, Faure C, Fezeu L, et al. BMI in relation to sperm count: an updated systematic review and collaborative meta-analysis. Hum Reprod Update 2013; 19(3): 221-231

6 Shaha C, Tripathi R, Mishra DP. Male germ cell apoptosis: regulation and biology. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2010; 365(1546): 1501-1515

7 Erdemir F, Atilgan D, Markoc F, et al. The effect of dietinduced obesity on testicular tissue and serum oxidative stress parameters. Actas Urol Esp 2012; 36(3): 153-159

8 吕毅清, 陈斌, 胡凯, 等. 精子凋亡率与精子密度、活率、活力及活性氧关系探讨. 中国男科学杂志 2009; 23(2): 34-37

9 Aitken RJ, Baker MA. Causes and consequences of apoptosis in spermatozoa; contributions to infertility and impacts on development. Int J Dev Biol 2013; 57(2-4): 265-272

10 Walczak-Jedrzejowska R, Wolski JK, Slowikowska-Hilczer J. The role of oxidative stress and antioxidants in male fertility. Cent European J Urol 2013;66(1):60-67

（2014-10-18收稿）

**通讯作者, E-mail: jiansongwang@yahoo.com

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.03.002

中图分类号R698. 2

*基金项目资助: 国家自然科学基金（81260374）

Study on early sperm apoptosis in male infertility with overweight and obesity*

Bai Shuangyong1, Wang Jiansong1**, Zhao Qinghua2
1. Department of Urology, The second affi liated Hospital, Kunming medical university, kunming 650000, China; 2. Department of Gynaecology, The second affi liated Hospital, Kunming medical university
Corresponding author: Wang Jiansong, E-mail: jiansongwang@yahoo.com

AbstractObjective To investigate early sperm apoptosis occurrence and infl uence factor for better understand the overweight and obesity in male fertility. Metthhooddss Semen samples were collected from 26 normal males(the control group) and 12 male infertility patients with overweight(overweight group), as well as 14 male infertility with obesity( obesity group). Semen routine analysis was carried out. Early apoptosis of sperm was detected by fl ow cytometry. Levels of reactive oxygen species and glutathione peroxidase in the seminal plasma were assayed by ELISA. Ressuullttss Early apoptosis rates of sperm in overweight group (15.73±6.49) % and obesity group (16.16±6.57) % were all signifi cantly higher than that in the control group (10.48±6.21) % (P＜0.05), but there was no signifi cant difference in early apoptosis rate between overweight group and obese group (P＞0.05). Body mass index (BMI) was negatively related with the rate of sperm activity in semen analysis (R =- 0.31, P＜0.05), and positively correlated with the inactivity rate of sperm (R = 0.31, P＜0.05) and early apoptosis rate of sperm (R = 0.41, P＜0.01). Reactive oxygen species was positively correlated with early apoptosis rate of sperm (R = 0.61, P＜0.01), glutathione peroxidase and early apoptosis rate of sprm showed a negative correlation (R =-0.46, P＜0.01). Concluussiioonn The level of reactive oxygen species in seminal plasma were increased in male infertility with overweight and obesity, and low level of glutathione peroxidase caused early apoptosis of sperm may result in ocurrence of male infertility with overweight and obesity.