HPLC法同时测定5种抗癫痫药的血清药物浓度

周 晶王漪檬赵宁民段虹飞马爱玲赵红卫郭玉忠

1.郑州大学基础医学院，河南郑州 450001；2.郑州大学人民医院 河南省人民医院药学部，河南郑州 450003

HPLC法同时测定5种抗癫痫药的血清药物浓度

周 晶1,2王漪檬2赵宁民2段虹飞2马爱玲2赵红卫2郭玉忠1▲

1.郑州大学基础医学院，河南郑州 450001；2.郑州大学人民医院 河南省人民医院药学部，河南郑州 450003

目的建立同时测定拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡马西平和氯硝西泮血清浓度的HPLC法。方法血清样品经甲醇沉淀蛋白后直接进样分析，色谱柱为Waters C18（5μm，4.6×250mm）柱，流动相为甲醇-水（55∶45），检测波长235nm。结果在一定浓度范围内(拉莫三嗪：1.3～50.0μg/mL；苯巴比妥：2.5～100.0μg/mL；苯妥英：2.2～70.0μg/mL；卡马西平：1.8～35.0μg/mL；氯硝西泮：2.5～80.0μg/mL），各药物的峰面积与浓度呈良好的线性关系。低、中、高浓度的质控样品回收率均高于95%，相对标准差（RSD）均小于10%。结论本方法操作简便，结果稳定可靠，适用于临床进行血药浓度监测。

抗癫痫药；血药浓度；高效液相色谱法；治疗药物监测

药物反应会因人而异，给予相同剂量的药物，在患者身上可能会出现不同的药理作用，开展治疗药物监测可以提高药物临床疗效、减少毒副反应[1]。拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡马西平和氯硝西泮均属安全范围较窄的药物，在临床应用中需开展血药浓度监测。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（戴安P680），电子分析天平（岛津AUW 120D）；液体快速混合器（YKH-II，江西医疗器械厂）；高速冷冻离心机（HC-3618R，科大创新股份有限公司中佳分公司）；多管架自动平衡离心机（TDZ5-WS型，湘仪离心机厂），可调移液器（eppendorf）等。

1.2 试药

拉莫三嗪对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100775-200401）；苯巴比妥对照品（中国食品药品检定研究院，批号：1222-9602）；苯妥英对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100210-201002） ；卡马西平对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100142-201105）；氯硝西泮对照品（中国食品药品检定研究院，批号：171227-200302）；甲醇为色谱纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Waters C18（5μm，4.6×250mm）；流动相：甲醇-水（55∶45）；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长：235nm；进样量：20μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备液的制备 准确称取拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡马西平和氯硝西泮对照品适量，分别甲醇溶解并定容至10mL，配成浓度分别为500、1000、700、350、800μg/mL，的对照品储备液。

2.2.2 标准血样的制备 分别精密移取各药物对照品储备液适量，用甲醇稀释成为标准系列溶液。将上述标准系列溶液加入适量空白血清，配制成含拉莫三嗪1.3、2.5、5.0、12.5、25.0、50.0μg/mL；含苯巴比妥2.5、5.0、20.0、25.0、50.0、100.0μg/mL；含苯妥英2.2、4.4、8.8、17.5、35.0、70.0μg/mL；含卡马西平1.8、4.4、7.0、8.8、17.5、35.0μg/mL；含氯硝西泮2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0μg/mL的系列浓度混合标准血清溶液，置-40℃冰箱保存。

2.2.3 质控血清的制备 分别精密移取各药物对照品储备液适量，用甲醇稀释成为标准系列溶液。将上述标准系列溶液加入适量空白血清，配制成；含拉莫三嗪1.3、12.5、50.0μg/mL；含苯巴比妥2.5、25.0、100.0μg/mL；含苯妥英2.2、17.5、70.0μg/mL；含卡马西平1.8、8.8、35.0μg/mL；含氯硝西泮2.5、20.0、80.0μg/mL的低、中、高质控血清溶液，置-40℃冰箱保存。

2.3 样品处理方法

取200μL血清样品，加入600μL甲醇，涡旋混匀，15000r/min离心5min。取上清液20μL进样。

2.4 专属性试验

取空白血清按“2.3”项下方法处理后分析，考察内源性物质干扰；根据临床常用抗癫痫药情况，在相同色谱条件下考察丙戊酸、奥卡西平、托吡酯对实验的干扰。在本试验色谱条件下，内源性物质和上述3种药物不干扰测定，各药物分离良好（分离度R≥1.5）。5种药物的保留时间依次为拉莫三嗪3.821min、苯巴比妥4.465min、苯妥英8.520min、卡马西平10.248min、氯硝西泮11.384min。高效液相色谱图见图1。

2.5 线性关系考察

取系列混合标准血清溶液各200μL，按“2.3”项下样品处理法操作后进样。以对照品峰面积（y）对浓度（x）进行线性回归，得回归方程与线性关系见表1。结果表明，各药物的峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.6 精密度与准确性

取低、中、高三个浓度质控血清，按“2.3”项下方法处理，取上清20μL进样分析，每个样本连续进样3次，计算相对标准差（RSD），评估精密度，结果见表2。

图1 高效液相色谱图：A空白血清色谱图；B 样品色谱图（1拉莫三嗪、2苯巴比妥、3苯妥英、4卡马西平、5氯硝西泮）

表1 回归方程与线性范围

取低、中、高三个浓度质控血清，按“2.3”项下方法处理，每个浓度平行制备3份，取上清20μL直接进样分析。代入“2.5”项下回归方程计算，以所得检测数值除以质控血清理论数值，得相对回收率，以相对回收率结果考察准确性，结果见表2。

2.7 室温稳定性试验

取中浓度质控血清，按“2.3”项下方法处理，分别在室温（25℃）放置4、8、12h后取上清20μL进样分析。各药物相对标准差（RSD）均在5%以内表明血浆样品在室温放置12h稳定性良好，临床中收取的血样在12h内检测可满足要求。见表3。

3 讨论

拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡马西平和氯硝西泮均属安全范围较窄的药物，在临床应用中需开展血药浓度监测[2-6]。过去受检测设备限制，检测上述多种药物需在不同色谱条件下分别进行检测，耗时耗力。如果能将上述药物在一个色谱条件下同时检测，将大大节省人力物力，具备更好的临床应用价值。随着检测技术的进步，当前已经能建立同时测定多种药物的方法学[7-9]。本研究建立了同时测定拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡马西平和氯硝西泮血清浓度的HPLC法，方法操作简便，结果稳定可靠，适用于临床进行血药浓度监测和药代动力学研究。

表2 精密度与准确性试验

表3 室温稳定性试验

高效液相检测波长的选择：本研究分别考察了210、235、254、285nm等波长，经过对比，最终选择235nm作为检测波长。在该波长下内源性物质干扰小，适合这几种药物的检出和分离。流动相选择时，未选择乙腈，选择甲醇-水作为流动相，该流动相价廉且分离效果能满足检测要求。生物样品处理时，采用了甲醇沉淀蛋白法，操作快捷，处理得到的样品干扰较少，能满足检测需要。

精密度是指多次重复测定同一样本时各测定值之间彼此相符合的程度，用于评估样本检测过程中随机误差的大小。本研究中，拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡马西平和氯硝西泮的低、中、高三个浓度质控血清连续进样3次，相对标准差（RSD）均小于10，表明本方法精密度较好。

准确度指在一定实验条件下多次测定的平均值与真值相符合的程度，在临床检测中常用回收率来表示。本研究中，拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡马西平和氯硝西泮的低、中、高三个浓度质控血清的相对回收率均高于95%，表明本方法学准确度较佳。

采用HPLC法可同时监测多种药物的血药浓度，方法准确可靠，实用性强，适用性广[10-11]。本研究建立的方法操作简便，结果稳定可靠，可用于各级医疗机构开展治疗药物监测和药代动力学研究。

[1] Abdessadek M，Magoul R，Amarti A，et al. Customizing dosage drugs what contribution in therapeutic drug monitoring? [J].Ann Biol Clin（Paris），2014，72（1）：15- 24.

[2] 马爱玲，张海峰，赵宁民，等.某院2009～2011年抗癫痫药血药浓度监测结果分析[J].中国医药科学，2013，3（3）：59-60.

[3] 许德河，陈英颖，孙颖.125例癫痫患者抗癫痫药物血药浓度监测结果分析[J].中国乡村医药，2014（5）：46-47.

[4] 宋素异.抗癫痫药物血药浓度监测结果分析[J].中国现代药物应用，2014（10）：94-96.

[5] 任婷麟，张沂，于春令，等.海军总医院2013年4种常规药物血药浓度监测结果分析[J].海军医学杂志，2014（4）：263-264.

[6] 鞠永静.1692例抗癫痫药物血药浓度监测结果与分析[J].药品评价，2014（18）：33-34，37.

[7] Helmy SA，El-Bedaiwy HM. Validation of a liquid chromatography method for the simultaneous determination of several nonsteroidal anti-inflammatory drugs in human plasma for therapeutic drug monitoring[J].Ther Drug Monit，2014，36（1）：100-107.

[8] Serralheiro A，Alves G，Fortuna A，et al. First HPLCUV method for rapid and simultaneous quantification of phenobarbital，primidone，phenytoin，carbamazepine，carbamazepine-10，11-epoxide，10，11-trans-dihydroxy-10，11-dihydrocarbamazepine，lamotrigine，oxcarbazepine and licarbazepine in human plasma[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013，925（1）：1-9.

[9] 刘亦伟，王长连，黄品芳．高效液相色谱法同时测定拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡马西平的血药浓度[J].中国医院药学杂志，2012，32（20）：1660-1662.

[10] 宋闫军.HPLC法测定复方氨酚烷胺片中对乙酰氨基酚的含量[J].中国医药科学，2013，3（2）：102-103.

[11] 武晓红，赵辉，肖娴.高效液相色谱法测定福多司坦原料药的含量[J].中国医药科学，2013，3（4）：103-104.

Simultaneous determination of concentration of 5 kinds of antiepileptic in human serum by HPLC

ZHOU Jing1,2WANG Yimeng2ZHAO Ningmin2DUAN Hongfei2MA Ailing2ZHAO Hongwei2GUO Yuzhong1

1.Basic Medical College of Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China; 2.Department of Pharmacy, People's Hospital of Zhengzhou University,He'nan Province People's Hospital, Zhengzhou 450003, China

ObjectiveTo develop a new method for simultaneously determining Lamotrigine, phenobarbital, phenytoin, carbamazepine and clonazepam in human serum by HPLC.MethodsSerum samples were analyzed after protein deposition by methanol.The HPLC method was performed on the column of Waters C18(5μm, 4.6×250mm) with mobile phase consisted of ethanol-water (55∶45), the UV detection wavelength was 235nm.ResultsIn a certain range of concentration (lamotrigine: 1.3-50.0μg/mL; phenobarbital: 2.5-100.0μg/mL; phenyltoin: 2.2-70.0μg/mL; carbamazepine: 1.8-35.0μg/mL; clonazepam: 2.5-80.0μg/mL), there was a good linear relationship between peak area and concentration of each drug. Low、medium and high concentration of the quality control sample recovery rate was higher than 95%, the relative standard deviation (RSD) is less than 10%.ConclusionThe method provides a sensitive, accurate, precise and reliable analytical procedure for clinical monitoring of 5 compounds which is suitable for therapeutic drug monitoring.

Antiepileptic; Plasma concentration; HPLC; TDM

R742.1

B

2095-0616（2015）05-39-03

2014-12-08）

河南省科技攻关计划项目（142102310416）。

▲通讯作者