HBV感染患者循环miR- 24的表达与作用机制

梁 宏，朱永昌，陆若飞

(1.启东市第三人民医院 感染科；2.启东市人民医院 肿瘤科 启东肝癌研究所，江苏 启东 226200)



研究论文

HBV感染患者循环miR- 24的表达与作用机制

梁 宏1，朱永昌1，陆若飞2*

(1.启东市第三人民医院 感染科；2.启东市人民医院 肿瘤科 启东肝癌研究所，江苏 启东 226200)

目的检测乙型肝炎病毒(HBV)感染患者血清中循环miR- 24表达的变化，并探讨miR- 24与HBV感染的关系及作用机制。方法收集45例HBV感染者和22例健康正常对照者的一般临床资料和血清样本，用实时定量PCR(qRT-PCR)检测两者血清中miR- 24的表达；用ELISA法检测乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝E抗原(HBeAg)的含量；在HepG2.2.15细胞中转染miR- 24模拟物(mimic)48 h，qRT-PCR检测HepG2.2.15细胞中miR- 24表达；再用ELISA法检测HBsAg和HBeAg含量，并用qRT-PCR检测细胞中前C基因HBV RNA表达。结果HBV感染组血清中循环miR- 24的表达水平均显著低于对照组(P<0.01)。HepG2.2.15细胞中HBsAg和HBeAg含量均显著高于HepG2细胞(P<0.01)。在HepG2.2.15细胞中转染miR- 24 mimic后，miR- 24的表达显著增高(P<0.01)；miR- 24显著抑制了细胞中HBsAg和HBeAg分泌(P<0.01)；并抑制了细胞中前C基因HBV RNA表达(P<0.05)。结论miR- 24在HBV感染患者体内表达下调，增强miR- 24表达的治疗策略有望使HBV感染患者受益。

microRNA- 24；乙肝病毒；乙肝表面抗原；乙肝E抗原

miRNA是一类非编码单链小RNA分子[1- 2]，最近的研究表明在病毒感染宿主的过程中，miRNA可能扮演了重要的作用[1]。寻找HBV(hepatitis B virus, HBV)感染后肝细胞内表达水平发生改变的miRNA，研究这些特定miRNA功能，看其是否在HBV感染过程中发挥作用，或许有利于进一步揭示HBV感染，特别是慢性HBV感染的致病机制[3- 4]。在HBV感染HepG2细胞后表达显著差异的miRNA就有miR- 24[5]。

HepG2.2.15细胞是人肝癌细胞HepG2转染HBV基因后的细胞，HBV基因已稳定整合，能分泌各种病毒蛋白和病毒颗粒，是研究HBV感染的一个理想的体外模型[6- 7]。本研究拟检测HBV感染患者血清中循环miR- 24表达的差异，并探讨miR- 24抗病毒的作用，为HBV感染提供新的治疗策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本的收集:收集从2012年5月至2014年12月在江苏省启东市人民医院和启东市第三人民医院门诊及住院部送检的HBV-DNA(+)患者的一般临床资料和血清标本，共45例，其中男性患者29例(64.4%)，女性患者16例(35.6%)，年龄28～68岁，平均年龄为(43.0±9.5)岁。健康正常对照组为同时期健康体检者22例。具体数据见表1。排除其他肝脏疾病(如酒精性肝炎等)；排除合并其他肝炎病毒及HIV感染；排除近期使用免疫抑制剂治疗者。所有参与者都签署知情同意书同时本实验获得医院伦理委员会讨论通过。肝功能指标(ALT、AST)、HBV-DNA定量检测由启东市第三人民医院检验科完成。

1.1.2 试剂:人肝癌细胞HepG2(中国科学院上海生科院细胞资源中心)，HepG2.2.15(博慧斯生物医药科技有限公司)。胎牛血清、RPMI- 1640培养基、Lipofectamine 2000、Trizol、胰蛋白酶(Invitrogen公司)。TaqMan miRNA分离试剂盒、TaqMan microRNA检测试剂盒、TaqMan microRNA Assay和TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems公司)。G418(Sigma公司)。miR- 24 RT引物、miR- 24 mimic和阴性对照(mimic control)(上海Genepharma公司)。HBV前C基因PCR引物(上海英骏生物技术公司)。HBsAg和HBeAg ELISA检测试剂盒(上海实业科华生物技术有限公司)。

1.2 方法1.2.1 细胞培养:将HepG2细胞培养于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI- 1640培养基中。HepG2.2.15细胞培养于含10%胎牛血清(FBS)、38 μg/mL G418的RPMI- 1640培养基中。HepG2和HepG2.2.15细胞均在37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下进行培养。倒置显微镜下观察细胞增殖状态，细胞增殖呈70%～80%汇合状态时，以0.25%胰蛋白酶消化传代，隔日换液，每3～4天传代1次。收集对数期细胞进行实验。

1.2.2 检测循环miR- 24在两组受检者中的表达:用qRT-PCR方法检测两组受检者中miR- 24的表达。收集两组受检者血清， 以TaqMan miRNA分离试剂盒提取RNA，用TaqMan microRNA Assay和TaqMan Universal PCR Master Mix来检测成熟miR- 24的表达，以U6作为内参基因。所有反应均设立3个复孔。记录每个反应管中标本的CT 值， 实验结果用qRT-PCR中的相对定量法进行分析。以2-△△CT表示HBV感染患者血清中miR- 24表达量相对于健康正常对照组表达量的变化倍数，其中△△CT=(CTmiR- 24-CTU6)HBV-(CTmiR- 24-CTU6)对照。

表1 两组受检者的临床特征比较

*P<0.01 compared with control.

1.2.3 ELISA法检测HepG2和HepG2.2.15 细胞HBsAg和HBeAg的分泌:根据试剂盒说明书操作。加入待测HepG2和HepG2.2.15细胞的隔夜培养上清各50 μL，设阴性对照和阳性对照(标准品)。结果判断：样品平均A值/阴性对照平均A值≥2.1判断为阳性，否则为阴性。阴性对照A值低于0.05时作0.05计算，高于0.05时按实际A值计算。

1.2.4 检测HepG2.2.15细胞中转染miR- 24 mimic对miR- 24表达的影响:将正常培养的HepG2.2.15细胞以3×105个/mL均匀接种于6孔培养板，每孔体积1 mL。待细胞贴壁后，按Lipofectamine 2000转染说明书进行miR- 24 mimic和阴性对照(mimic control)的转染。同时设未转染组。用不含血清的MEM培养基分别稀释miR- 24 mimic和mimic control，然后取脂质体Lipofectamine 2000稀释到MEM培养基中，轻轻混匀后在室温下温育5 min，再将稀释的Lipofectamine 2000分别与稀释的miR- 24 mimic和mimic control混合，轻轻混匀后在室温下温育20 min，以形成复合物。将复合物加入到含HepG2.2.15细胞的培养板中混合，置于37 ℃、5% CO2的培养箱内，5 h后更换含10%胎牛血清的MEM培养基，继续培养48 h。

以TaqMan miRNA分离试剂盒分别提取各组细胞的RNA，采用qRT-PCR方法检测各组HepG2.2.15细胞中miR- 24表达变化。

1.2.5 检测miR- 24对HepG2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg分泌和HBV RNA表达的影响:HepG2.2.15细胞在转染miR- 24 mimic 48 h后，ELISA法检测miR- 24对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响，方法同上。

qRT-PCR法检测miR- 24对HepG2.2.15细胞中HBV前C基因RNA表达的影响，收集转染miR- 24 mimic的HepG2.2.15细胞，加入Trizol试剂，按照产品说明书操作步聚，提取样品的总RNA，然后采用反转录试剂盒进行反转录，根据产品说明书操作步聚合成第一链。qRT-PCR检测HBV前C基因RNA表达。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 循环miR- 24在两组受检者中的表达情况

miR- 24在HBV感染患者血清中的表达为0.061±0.059，显著低于健康人对照组的1.001±0.103(P<0.01)。miR- 24在HepG2.2.15细胞中的表达为0.039±0.006，显著低于HepG2细胞的0.12±0.014(P<0.01)。2.2 HepG2和HepG2.2.15分泌HBsAg和HBeAg情况

稳定表达HBV病毒颗粒的HepG2.2.15细胞中分泌的HBsAg和HBeAg显著高于HepG2细胞和阴性对照组(P<0.01)(图1)。

HBsAg HepG2.2.15(2.49±0.08); HBeAg HepG2.2.15(1.96±0.07); HBsAg positive control(2.56±0.06); HBeAg positive control(2.64±0.10); *P<0.01 compared with negative control or HepG2图1 ELISA法检测HepG2和HepG2.2.15分泌HBsAg和HBeAg情况Fig 1 Detection of HBsAg and HBeAg in the supematant of HepG2 and HepG2.2.15 cells by ELISA(n=3)

2.3 HepG2.2.15细胞中转染miR- 24 mimic对miR- 24表达的影响

miR- 24 mimic转染组中miR- 24的表达11.59±1.10显著高于正常对照组1.05±0.09和阴性对照组1.03±0.13(P<0.01)。

2.4 miR- 24对HepG2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg分泌和HBV RNA表达的影响

miR- 24 mimic转染组中HBsAg和HBeAg的含量显著低于未转染组(P<0.01)和阴性对照组(P<0.01)(图2)。

HBsAg mimic(0.87±0.07); HBeAg mimic(0.79±0.05); *P<0.01 compard with normal control or mimic control图2 ELISA法检测miR- 24对HepG2.2.15细胞中HBsAg和HBeAg分泌的影响Fig 2 Effect of miR- 24 on secretion of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells by ELISA(n=3)

miR- 24 mimic转染组中前C基因RNA表达为0.553±0.055，明显低于正常对照组的1.046±0.082 (P<0.05)和阴性对照组的1.016±0.068 (P<0.05)。

3 讨论

HBV感染是严重威胁中国人类健康的重大传染病，在其致病过程中，宿主miRNA同样参与了病毒复制、转录、包装等自身生命活动，成为研究HBV与宿主相互作用的重要窗口[8]。研究特定靶向干预miRNA，探索其能否改变HBV的体内感染过程，为进一步开发基于miRNA的新型抗HBV药物提供

理论和实验依据。

循环miRNA的发现为人类疾病的诊断和预测提供了有用的生物标志物[9]。miR- 24在许多疾病中表达失调，如乳腺癌、非小细胞肺癌等[10]。在HBV感染HepG2细胞后表达显著差异的miRNA就有miR- 24[5]。本研究先用qRT-PCR方法检测HBV感染患者和健康正常对照者血清中miR- 24的表达。结果发现：循环miR- 24在HBV感染患者血清中的表达显著下调。提示miR- 24可能在HBV感染患者血清中发挥着抗病毒作用。

HBV核衣壳是由核心基因(core)编码，在其上游有一个前核心区基因(pre-core)，它与core基因区共同表达的产物，经蛋白水解和信号肽剪切后，形成分泌型HBeAg[11]。HBeAg的表达及机体对此抗原的免疫反应与疾病的病理过程和临床表现有重要关系[12]。血清HBsAg在一定程度上反映了体内HBV复制水平。故在临床上，血清HBsAg常常被作为HBV诊断和治疗的评价指标。本研究利用ELISA法检测HepG2和HepG2.2.15细胞上清中HBsAg和HBeAg的浓度。结果表明，HepG2.2.15细胞中分泌的HBsAg和HBeAg显著高于HepG2细胞和阴性对照组，提示HepG2.2.15细胞能分泌病毒蛋白，可以作研究HBV感染的体外模型。本研究通过在HepG2.2.15细胞转染miR- 24 mimic过表达miR- 24，并检测miR- 24对HepG2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg分泌和HBV RNA表达的影响。结果发现，miR- 24抑制了HepG2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg分泌和HBV RNA表达。提示miR- 24通过抑制HepG2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg分泌和HBV RNA表达，发挥抗病毒作用。通过在线软件(Targetscan)预测，miR- 24调控的靶基因有IFN-γ(interferon, gamma)等，但miR- 24抗病毒的分子机制还需进一步研究。

综上所述，miR- 24在HBV感染患者体内表达下调，增强miR- 24表达的治疗策略有望使HBV感染患者受益。

[1] Lyra-Gonzalez I, Flores-Fong LE, Gonzalez-Garcia I,etal. MicroRNAs dysregulation in hepatocellular carcinoma: Insights in genomic medicine [J]. World J Hepatol, 2015, 7:1530- 1540.

[2] Simpson LJ, Ansel KM. MicroRNA regulation of lymphocyte tolerance and autoimmunity [J]. The J Clini Investi, 2015, 125:2242- 2249.

[3] Giray BG, Emekdas G, Tezcan S,etal. Profiles of serum microRNAs; miR- 125b- 5p and miR223- 3p serve as novel biomarkers for HBV-positive hepatocellular carcinoma [J]. Mol Biol Rep, 2014, 41:4513- 4519.

[4] Mizuguchi Y, Takizawa T, Uchida E. Host cellular microRNA involvement in the control of hepatitis B virus gene expression and replication [J]. World J Hepatol,2015, 7:696- 702.

[5] Kumar M, Sharma Y, Bandi S,etal. Endogenous antiviral microRNAs determine permissiveness for hepatitis B virus replication in cultured human fetal and adult hepatocytes [J]. J Medi Virol, 2015, 87:1168- 1183.

[6] Yang H, Fu Q, Liu C,etal. Hepatitis B virus promotes autophagic degradation but not replication in autophagosome [J]. Biosci Trends, 2015, 9:111- 116.

[7] Inoue J, Krueger EW, Chen J,etal. HBV secretion is regulated through the activation of endocytic and autophagic compartments mediated by Rab7 stimulation [J]. J Cell Sci, 2015, 128:1696- 1706.

[8] Li D, Peng JJ, Tan Y,etal. Genetic variations in microRNA genes and susceptibility to hepatocellular carcinoma [J]. Geneti Mole Res: GMR, 2015, 14:1926- 1931.

[9] Gilad S, Meiri E, Yogev Y,etal. Serum microRNAs are promising novel biomarkers [J]. PLoS One, 2008, 3:e3148, doi: 10.1371/journal.pone.0003148.

[10] Katoh M. Cardio-miRNAs and onco-miRNAs: circulating miRNA-based diagnostics for non-cancerous and cancerous diseases [J]. Front Cell Deve Bio, 2014, 2:61, doi: 10.3389/fcell, 2014.00061.

[11] Zhang YY, Hu KQ, Duan Z. New perspective on the natural course of chronic HBV infection [J]. Front Med, 2014, 8:129- 134.

[12] Yeh ML, Huang CF, Hsieh MY,etal. Comparison of the Abbott RealTime HBV assay with the Roche Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HBV assay for HBV DNA detection and quantification [J]. J Clin Virol, 2014, 60:206- 214.

新闻点击

童年时的肾小球疾病与成年的高血压有关

据美国WebMD医学新闻网(2014- 03- 29)报道，根据超过38 000名男性以色列军人的世代研究结果，诊断有肾小球疾病的儿童成年时发生高血压的风险上升。

以色列Tel-Hashomer IDF 医疗公司的Asaf Vivante医生等人在2014- 03- 19JAMA杂志发表这篇研究。

研究者指出，发生肾小球疾病的儿童多数预后良好，征兆与症状完全缓解，但还未充分了解这个诊断的长期后遗症。

为了探究这个问题，研究者对38 144名男性军人进行了世代研究，这些军人在1970—1997年由医疗人员评估纳入，对他们进行定期评估直到退伍、诊断有高血压(收缩压>140 mmHg或舒张压>90 mmHg)或是到2010年12月31日为止，以先达到的条件为准。

研究者排除一开始即诊断有未缓解的肾小球疾病、高血压、糖尿病、活性类风湿疾病或其他任何肾脏或泌尿道问题者。

研究者发现，儿童时期已经解决的肾小球疾病和成年时发生高血压有显著关联。结论指出，儿童时期的肾小球疾病代表肾脏有连续性损伤，在可用标准化检验方式测得丧失肾脏分泌功能前即被治好，后续的初次表征即为成人高血压。

Expression of circulating miR- 24 in patients with HBV infection and relative mechanisms

LIANG Hong1, ZHU Yong-chang1, LU Ruo-fei2*

(1.Dept. of Infectious Disease, the Third People’s Hospital of Qidong; 2.Dept. of Oncology, Qidong People’s Hospital, Qidong Liver Cancer Institute, Qidong 226200, China)

Objective To detect the expression of circulating miR- 24 in patients with hepatitis B virus (HBV) infection, and to identify the relationship between miR- 24 expression and HBV infection and the mechanisms. Methods Clinical information and laboratory date from 45 patients with HBV infection and 22 health normal controls were collected. qRT-PCR was used to detect the expression of miR- 24 in patients with HBV infection and health normal controls. ELISA was used to detect the contents of hepatitis B surface antigen (HBsAg) and hepatitis B E antigen (HBeAg). After the HepG2.2.15 cell was transfected with miR- 24 mimic for 48 hours, the expression of miR- 24 was analyzed by qRT-PCR. ELISA was used to measure HBsAg and HBeAg. qRT-PCR was used to detect the expression of Pre-Core HBV RNA. Results The expression of circulating miR- 24 in patients with HBV infection was significantly lower than that of in health normal controls (P<0.01). The contents of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 were significantly higher than those of in HepG2. The expression of miR- 24 was higher in HepG2.2.15 after transfected with miR- 24 mimic for 48 hours.

miR- 24 decreased the contents of HBsAg and HBeAg (P<0.01), and inhibited the expression of Pre-Core HBV RNA (P<0.05) in HepG2.2.15 cell, respectively. Conclusions The expression of miR- 24 in patients with HBV infection is down regulated. Treatment based on the enhanced expression of miR- 24 may be a promising strategy for HBV infection.

microRNA- 24; hepatitis B virus (HBV); hepatitis B surface antigen (HBsAg); hepatitis B E antigen (HBeAg)

2015- 07- 23

2015- 10- 23

1001-6325(2015)12-1648-05

R575.1

A

*通信作者(corresponding author)：lrf720508@163.com