DAPK基因甲基化与肿瘤相关性的研究进展△

李水琴 黄义德 林尧

福建师范大学生命科学学院，福州350000

DAPK基因甲基化与肿瘤相关性的研究进展△

李水琴 黄义德 林尧#

福建师范大学生命科学学院，福州350000

死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）基因启动子区域高甲基化可使其表达沉默，从而抑制细胞凋亡，诱导肿瘤的发生和转移。在不同肿瘤类型或关于同一类肿瘤的不同报道中，DAPK基因甲基化数据相差很大。此外，大多数DAPK基因甲基化研究缺乏相应mRNA或蛋白表达数据。因此，规范DAPK甲基化及表达检测手段，明确其作用机制，对肿瘤中的DAPK研究至关重要。

肿瘤；恶性肿瘤；启动子甲基化；死亡相关蛋白激酶

据世界卫生组织报道，肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一。2012年肿瘤造成820万人死亡，其中肺癌、肝癌和胃癌位据前三。在未来20年中，估计每年肿瘤病例将上升到2200万。研究肿瘤致病机制，寻找有效的肿瘤治疗方法，是生物学与医学界的重要研究课题。表观遗传学是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因发生可遗传的遗传信息变化，并最终导致可遗传的表型变化，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递并具有可逆潜能[1]。在肿瘤中，如DNA甲基化等表观遗传学修饰可以通过调节基因的表达影响肿瘤的发生与发展。DAPK基因高甲基化常导致其表达量下降，且在多种肿瘤中发现了DAPK基因的甲基化现象（图1）[2]，因而备受关注，吸引了大量的研究者们对DAPK基因甲基化和肿瘤之间的关系进行研究。

1 DAPK的生物学功能与肿瘤

DAPK是一种钙调蛋白（CaM）调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，基因定位于人类染色体9q34.1，转录成熟的mRNA全长为5.9 kb，编码蛋白分子质量为160 kDa。DAPK可参与调控多种细胞生理过程，如细胞凋亡、自噬、迁移及细胞膜起泡等[3]，与恶性肿瘤发生、发展、转移密切相关[4]。例如，将DAPK引入到具有高转移能力的老鼠肺癌细胞中可以延缓恶性肿瘤细胞的生长并降低其转移潜能[5]。同时，DAPK可以通过磷酸化抑癌基因p19ARF激活抑癌基因p53，上调p53下游凋亡相关基因如Bcl相关X蛋白（Bcl-associated X protein，Bax）、凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptosis protease activating factor 1，Apaf-1）等的表达，从而抑制原癌基因cmyc和转录因子E2F1诱导的致癌性转化[6]。此外，DAPK还可以通过调控整合素-细胞分化调控蛋白42（cell division control protein 42，Cdc42）信号轴抑制细胞随机迁移，因此即使是在对DAPK诱导的凋亡耐受的恶性肿瘤中，DAPK也有可能抑制恶性肿瘤细胞转移，从而起到抑癌基因的作用[7]。

2 DAPK基因的转录调控

DAPK基因序列缺乏TATA盒，但其翻译起始位点上游1500 bp的序列包含了多种转录因子结合位点，如转录因子1（transcription factor，Sp1）结合位点、激活蛋白2（activator protein 2，AP2）结合位点、E盒、CAAT盒及可与核因子-激活的B细胞的增强子κ轻链（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-kB）、激活蛋白1（activator protein 1，AP1）、E2F1等结合的共有序列结合位点[8]。

此外，在DAPK基因-172 bp到+489 bp之间（包括外显子1）运用亚硫酸氢钠测序，还发现在肺癌和乳腺癌细胞中存在一个额外的启动子[8]，即由双启动子调控DAPK基因表达（图2），而占主导作用的启动子1（-1294 bp到+214 bp）比启动子2（+272 bp到+612 bp）的活性高40%～50%。目前DAPK基因的转录调控机制仍未完全研究清楚，但已知在不同的外部信号刺激下，细胞中DAPK基因的表达受到了不同机制的调控。

2.1 DAPK基因转录的正调控因子

Martoriati等[9]通过EMSA和CHIP技术研究证明，在细胞受到DNA损伤（紫外照射、γ射线及多西环素处理等）时，p53作为正调控转录因子被招募到DAPK基因的外显子1上游或内含子1上（图2），诱导DAPK基因的转录。原癌基因c-Myc、转录因子E2F1过表达时，也可引起p53蛋白与DAPK基因启动子序列结合，从而上调DAPK的转录[9]。Benderska等[10]结合运用荧光显微技术等与电脑软件模拟DAPK-HSF1热休克蛋白因子1（heat shock factor protein 1，HSF1）蛋白间的相互作用，发现在肿瘤坏死因子（TNF）刺激结肠癌肿瘤细胞时，DAPK可以磷酸化HSF1蛋白的S230位点，pHSF1S230由细胞质进入细胞核，与DAPK基因启动子区域HSE序列（核心序列TTCCGGAA）结合，使DAPK的mRNA表达量约增加2倍[11]。此外，在细胞凋亡初期，转化生长因子-β（transforming grow th factor beta，TGF-β）下游的SMAD蛋白家族（如Smad2、Smad3、Smad4）可与急性骨髓性白血病（AML）家族中的转录因子相互作用，通过与DAPK基因启动子（-705至-352）的结合，上调DAPK的mRNA表达量[12-13]。C/EBP-β是另一个可正调节DAPK转录的转录因子[14]，C/EBP亚家族包括C/EBP-α、C/EBP-β、C/EBP-γ、C/EBP-δ、C/EBP-ε、C/EBP-ζ[15-16]。C/EBP-β可直接与DAPK启动子近端环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）应答元件CRE/ATF位点（核心序列GACG）结合，但是与启动子远端CBS位点（核心序列TGGG）的结合需要干扰素γ（interferon gamma，IFN-γ）的诱导（图2）[14]。此外，Gade等[17]研究发现在内质网应激状态下，处于前体状态的激活转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）与免疫球蛋白结合蛋白（binding immunoglobulin protein，BiP）分离，进入高尔基体。在高尔基体中，前体ATF6经IFN-γ的诱导后，通过细胞凋亡信号调节激酶1（ASK1-MKK3）途径中的p38促分裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）磷酸化ATF6的T166位点[18]，使之发生蛋白水解变成活性状态，进入细胞核内与C/EBP-β蛋白结合后共同与DAPK启动子近端cAMP应答元件CRE/ATF位点结合，诱导DAPK基因的表达[14]。

2.2 DAPK基因转录的负调控因子

促炎因子IL-6/STAT3可与DAPK基因启动子区域（-1471至-1821、-351至-631）结合，抑制DAPK基因的转录[13，19]，而DAPK也可通过蛋白间的相互作用改变信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的核定位信号，进而减弱STAT3的活性[13]。因此，二者形成了一个双向负调控关系。此外，Hayakawa等[20]发现转化生长因子β活化激酶1（MAP3K7）激活p52NF-KB的同时可与DAPK的CRE及NF-kB位点结合，招募转录因子如组蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylases2，HDAC2）、HDAC6等以抑制DAPK基因表达[13]。除开转录因子的结合外，DAPK基因启动子区域CpG岛的异常甲基化在调节DAPK基因的表达中亦发挥重要作用。Nakatsuka等[21]在甲状腺癌（TL）中研究发现，DAPK基因的5'非翻译区（5'UTR）的CpG岛是一个超甲基化的潜在靶点。而据在线软件分析推测，在DAPK基因翻译起始位点上游6237 bp中，共含有3个可能的CpG岛（图3）。另外，DNA甲基转移酶可以异常募集致癌蛋白到DAPK启动子上，最后使DAPK启动子区域出现DNA异常甲基化现象[7，22-24]，但详细调控机制有待进一步探索。

3 肿瘤中DAPK基因的甲基化

DAPK作为一种抑癌基因，其启动子在多种恶性肿瘤细胞中存在不同程度的高甲基化[25-27]。体内研究显示，DAPK基因在正常组织中均有表达，在多种原发性恶性肿瘤组织中表达低下或缺失，如食管癌[28]、肺癌[5]、大肠癌[29]、乳腺癌[30]、卵巢癌[24]、头颈部鳞癌（HNSCC）[31]等。Raveh等[7]研究指出，在原发性结肠癌患者中，DAPK基因的甲基化约占20%。在许多情况下，采用甲基化特异性PCR检测DAPK基因表达，发现因DAPK基因甲基化导致其转录后的mRNA表达量明显降低，并且在肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤患者的组织和患者的体液标本中都已检测到DAPK基因的异常甲基化现象[5，32]，但其甲基化频率不尽相同（图1）。Edgar等[33]指出，抑癌基因SFRP1和DAPK异常甲基化率在32个慢性淋巴细胞白血病（CLL）样品中分别占68.8%和50%。Bodoor等[34]也检测出DAPK基因在CLL样品中甲基化率约占36%，比抑癌基因p53甲基化率高出2倍之多。Bing等[35]发现DAPK启动子区域甲基化频率在正常胃组织和胃癌组织样品中分别约为17.7%、54.8%。Takeuchi等[36]检测研究95位幼年急性淋巴细胞白血病（ALL）患者得出，DAPK基因甲基化率占13%，并且相对T型患者，B型DAPK基因甲基化更常见。Harder等[37]揭示，DAPK基因启动子甲基化在34个肝癌样品中约占68%，但在16个正常肝组织中，其甲基化约占31%，表明DAPK启动子甲基化在肝癌患者中时常发生。此外，Flatley等[38]在研究宫颈癌细胞样本时得出，DAPK基因受甲基化的细胞可能更易感染人乳头瘤病毒（HPV）。

启动子异常甲基化在细胞癌变过程中是个早期、频发事件，可以作为肿瘤发生的敏感生物学标志物。Bing等[35]指出，胃癌组织样品比正常胃组织中DAPK启动子区域甲基化频率高3倍，即伴随胃致癌的过程，抑癌基因DAPK启动子甲基化率会上升，故可推测DAPK可作为胃致癌的标志。Krajnovic等[39]指出，在32个滤泡性淋巴瘤（FL）样本中，78%的样本检测到DAPK基因异常甲基化，而O-6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT）基因甲基化占59%，且这两种基因协同甲基化可以作为FL疾病复发和对药物抗性的标志。同时，Ogawa等[40]研究得出，在非小细胞性肺癌（NSCLC）和头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系中，主要因启动子甲基化导致DAPK基因沉默，使癌细胞获得抗表皮生长因子受体（epidermal grow th factor receptor，EGFR）治疗药物如埃罗替尼（erlotinib）、西妥昔单抗（cetuximab）的抗性，故可猜想，在抗EGFR治疗药物的耐受性研究中，DAPK基因可能作为一个新的靶基因研究目标。在DAPK完全甲基化且不表达DAPK的Burkitt淋巴瘤Raji细胞株中，用5-氮杂胞苷（5-Aza-dc）处理后可导致其去甲基化，从而使Raji细胞对IFN-γ的凋亡敏感性恢复。Sato等[41]在犬B细胞淋巴瘤细胞中也检测到类似结果，即用5-氮杂胞苷处理GL-1细胞后，DAPK基因表达的mRNA量及IFN-γ诱导的细胞凋亡均有增加。

Chung等[42]研究中枢神经系统肿瘤时发现，中枢神经细胞瘤中DAPK基因启动子甲基化频率远远超过少突胶质细胞瘤，但DAPK蛋白表达情况相反。这一研究突出了基因甲基化与蛋白表达之间存在的差异性。虽然在多个患者样品中检测DAPK启动子区域甲基化频率已有很多相关报道，但可能因研究者得到的患者信息及样本数量有限，在同一患者样品中，同时检测分析DAPK基因的DNA序列位点突变情况、转录表达的mRNA量及运用蛋白印迹、免疫组化方法检测DAPK蛋白量的研究寥寥无几，有必要在合适的样本中对这三个层面同时进行检测，从而进一步深入了解肿瘤中DAPK基因甲基化的生物学功能及临床意义。此外，DAPK甲基化检测在作为肿瘤标志物时，也应多考虑是否能够与其他基因的甲基化联合检测，从而能够更准确地为肿瘤诊断服务。例如，Ahmed等[43]抽取乳腺癌和良性乳腺疾病患者血液提取DNA分析，发现DAPK和Ras相关域含蛋白1（ras association domain-containing protein 1，RASSF1）抑癌基因都呈现不同程度的高甲基化现象，是否可以运用这2种基因甲基化频率协同上升作为乳腺癌早期诊断的标志有待更多的研究。对DAPK基因甲基化的研究，可能不仅为早期治疗诊断提供服务，如Kristensen等[44]指出，在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中，DAPK基因的甲基化和p53突变也有重要的预后价值。

4 展望

随着对DNA甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求，这些方法可分为3类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和利用测序寻找新的甲基化位点[45]。但在DAPK甲基化的研究中，大多运用前两者的研究方法，并且处理方式各异，包括基于PCR的甲基化分析、基于限制性内切酶的甲基化分析、基于重亚硫酸盐的甲基化分析和柱层法等。研究显示[2]，DAPK在各种肿瘤中甲基化情况的研究方法中，甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR，MSP）方法是应用最广泛的，约占72%，这种方法是利用可区别甲基化和非甲基化的引物通过PCR检测基因甲基化，其关键是引物设计。其次是巢式-MSP和RTMSP方法的运用，约占15%[2]，因基因检测或处理方法的不一致，有可能导致结果的差异性。例如在胆管癌中，运用MSP方法检测DAPK基因启动子甲基化情况，Yang等[46]发现其甲基化约占3%，但 Xiaofang等[47]运用巢式PCR方式检测到的DAPK基因启动子甲基化约占30.6%。因此DAPK基因的甲基化研究亟须在方法上建立一个统一的标准，以便于不同研究数据之间的横向比较。此外，在DAPK基因的甲基化研究中，新甲基化位点的发现较少，大部分的研究只集中在一个甲基化位点上，是否还有其他甲基化位点，这些位点的功能在不同肿瘤中是否有不同，有待进一步探索。

对于导致DAPK基因甲基化的分子机制，其中一种可能是因为某些未知原因导致的DAPK基因表达下降本来作为一种诱因导致染色质凝聚和组蛋白尾部修饰，进而使DAPK启动子甲基化，最后导致基因转录沉默[48]。这种基因甲基化机制在乳腺癌细胞雌激素受体信号通路[49]和前列腺癌细胞的谷胱甘肽S-转移酶[50]中已被证实。还有一种可能性是如Pulling等[8]指出，DAPK在转录沉默时存在组织特异性差异。在乳腺癌细胞中，启动子2的甲基化频率较高，但在肺癌细胞中，受甲基化影响较大的是启动子1，其甲基化机制需在不同的细胞中分别研究，可能存在较大的差异性。

DAPK启动子甲基化可能作为肿瘤早期诊断、治疗、转移和预后的分子标志物[51]，并为未来肿瘤的药物治疗提供分子生物学机制。虽然去甲基化药物在细胞水平已被证实且取得一定疗效，但在临床应用及其作用机制还有待深入研究。目前，DAPK抗肿瘤和抗炎症[52]作用也已成为研究的热点。

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国家自然科学基金青年科学基金（31301172）；福建省自然科学基金（2014J01122）#

（corresponding author），e-mail：yaolinfjfz@gmail.com

2015-03-22）