壳聚糖双胍盐酸盐络合碘制备及抑菌性能

徐宁宁，谢琳琳，唐阳，赛明泽，丁德润

（上海工程技术大学化学化工学院，上海 201620）

壳聚糖（CTS）是甲壳素脱乙酰化产物，是天然糖类中唯一大量存在的碱性氨基多糖，具有许多特殊的物理与化学性质和生理功能[1-3]，如无毒、生物相容性、组织修复和减少创面渗出等功能[4-7]，在医药材料、功能材料、药物释放等领域具有广阔的应用前景。由于壳聚糖分子间存在强的分子氢键，其化学性质较稳定，使其应用受到限制[8-10]。因此，可对壳聚糖进行化学改性得到壳聚糖衍生物，改善其物理及化学性质。本文在壳聚糖衍生物上络合单质碘，利用单质碘的广谱抗菌性，制备新型生物医用材料。

壳聚糖与碘分子结合稳定性较差，研究表明在壳聚糖结构单元上引入阳离子结构能稳定结合碘分子。本工作用双氰胺对壳聚糖进行胍基化改性，得到易溶于水的壳聚糖衍生物——壳聚糖双胍盐酸盐（CGH）。CGH 中含有多个氨基，增强了聚阳离子性，其正电荷对体积大、易变形的碘分子有强吸引作用。这种改性壳聚糖的碘络合物增强了抑菌效果，是一种高效低毒具有潜在应用价值的生物医用 材料。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

壳聚糖（医用级，平均相对分子质量为1.32 × 105，脱乙酰度90%），浙江金壳生物化学有限公司；双氰胺，化学纯，上海展云化工有限公司；碘，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司。

AVATAR370 FTIR 型红外光谱仪，美国Thermo Nicolet 公司；STA PT-1000 型热失重分析仪，德国Linseis 公司；D2 PHASER 型X 射线衍射仪，德国布鲁克AXS 公司。

1.2 实验步骤

1.2.1 CGH 的制备

取4.0g CTS 于250mL 三颈烧瓶中，加入150mL浓度为0.15mol/L 的盐酸溶液搅拌至CTS 完全溶解。加入3.0g 双氰胺，90℃搅拌2h，60℃减压蒸馏得浓缩液，加无水乙醇沉淀，真空抽滤。固体用无水乙醇浸泡洗涤抽滤（反复3 次），60℃真空干燥6h，得CGH 粉末[11]。反应式如式（1）。

1.2.2 CGH-I2的制备

配制 0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L 的碘乙醇液。分别取CGH 1.0g于上述各溶液中，室温下避光搅拌5h，抽滤，产物用无水乙醇少量多次洗涤，得CGH-I2，分别编号为A、B、C、D、E。

1.2.3 络合物中碘含量测定

采用碘量法[12]，定量称取1.0g 碘络合物于碘量瓶中，加入100mL 已标定的硫代硫酸钠溶液，室温避光搅拌4h。取上层清液用碘量法滴定过量的硫代硫酸钠。

1.3 性能测试

取CTS、CGH 溴化钾研磨、压片，进行IR 光谱分析，波数范围500～3800cm-1； X 射线衍射仪扫描分析谱图，扫描范围5°～80°；热失重（TG）曲线温度范围21～700℃，升温速率15℃/min。

1.4 抑菌性测试[13]

将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液分散到培养基内，菌浓约为1.08´105cell/L。取上述溶液30mL稀释10 倍装入直径为12cm 的培养皿中冷却固化。将CGH 和CGH-I2制成直径为10mm 的圆片，紫外灭菌30min。分别将圆片贴附于培养皿中不同位置，放入37℃恒温箱中培养24h，观察细菌生长情况，记录抑菌圈直径。

2 结果与讨论

2.1 IR 分析

CTS、CGH 的红外光谱如图1 所示。

由图1 可见，CTS 红外光谱在3423.19cm-1处为—OH 的伸缩振动和—NH2伸缩振动吸收峰，表现为一个强而宽的峰，表明有羟基与氨基间的氢键作用；2869.7cm-1处为C—H 伸缩振动吸收峰；1081.92cm-1处为糖类结构特征峰[14]；1594.92cm-1处为 N—H 的弯曲振动峰。CGH 红外光谱1637.34cm-1处为[—HN(C=NH)NH2]中C=N 的伸缩振动吸收峰[15]；1508.13cm-1处为—NH3+的弯曲振动吸收峰；1594.92cm-1处的—NH2振动峰消失，在1434.85cm-1处出现新的振动峰为C—N—C 的伸缩振动峰。以上可推断—NH2上发生了胍基化改性。

2.2 XRD 分析

CTS、CGH 的XRD 图谱如图2 所示。由图2 可见，CTS 在2θ = 10.5°和20.0°处有两个衍射峰是壳聚糖的两个特征衍射峰[16]，20.0°处衍射峰较强，可以看出壳聚糖是一种结晶性高分子。壳聚糖经双氰胺改性后得CGH 的衍射峰变弱，这是由于改性后破坏了壳聚糖分子内的氢键，分子间作用力变弱，使其结晶性受到破坏。

图1 CTS、CGH 的红外光谱图

图2 CTS、CGH 的XRD 图谱

2.3 TG、DTG 分析

CTS、CGH 的TG、DTG 曲线如图3、图4 所示。

由图3 可见，CTS 的降解分为两个阶段[17]：第一阶段在80℃开始，失重率达到8%，主要是失去水分子和小分子量的聚合物分解造成的；第二阶段失重在250℃开始，失重率达到40%，主要是由于壳聚糖分子链的热分解等复杂过程造成的。CGH 的降解也分成两个阶段，与CTS 不同的是其第二阶段失重在200℃开始，且CGH 失重率比CTS 失重率大，这是由于改性后破坏了壳聚糖分子内氢键使分子间作用力降低，分解温度下降。

由图4 可见，CTS、CGH 分别有两个热降解过程，且CTS、CGH 的最大热分解速率分别出现在311.6℃和230.2℃。

2.4 CGH-I2 中碘含量测定

图3 CTS、CGH 的TG 曲线

图4 CTS、CGH 的DTG 曲线

CGH 质量保持不变，改变单质碘的浓度，制备 出碘浓度不同的络合物。采用碘量法与浓度差法，找出CGH 与I2的最大质量比。实验数据见表1。

表1 CGH 与碘的络合物的质量比

由表1 可见，CGH 与碘络合的最大质量比为m(CGH)∶m(I2)=1∶0.46。壳聚糖经双氰胺改性后得到的CGH 中含有大量氨基，增强了聚阳离子性，且胍基质子化后得到一个非常稳定的胍离子，能在较大pH 值范围内保持正电性，碘分子的电子云密度大，容易受到正电荷吸引，产生静电吸引力，故CGH 有较强吸引碘分子的能力。

2.5 抑菌性分析

用抑菌环法[18]分别测CGH、CGH-I2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌环直径，确定其敏感性。依据抗菌素敏感度标准，抑菌环直径小于10mm 敏感度为耐药；10～15mm 敏感度为中度敏感；抑菌环直径大于15mm 敏感度为高度敏感。CGH、CGH-I2抑菌图片如图5、图6 所示。

由图5 可见，CGH(a)对大肠杆菌抑菌环直径为(6±1)mm，对大肠杆菌敏感度为耐药。CGH-I2(b)对大肠杆菌抑菌环直径为(18±1)mm，对大肠杆菌敏感度为高度敏感。

由图6 可见，CGH(a)对金黄色葡萄球菌抑菌环直径为(8±1)mm，对金黄色葡萄球菌为耐药。CGH-I2(b)对金黄色葡萄球菌抑菌环直径为(21±1)mm，对金黄色葡萄球菌敏感度为高度敏感。

图5 CGH(a)、CGH-I2(b)对大肠杆菌的抑菌性

图6 CGH(a)、CGH-I2(b)对金黄色葡萄球菌的抑菌性

CGH 通过静电吸引络合广谱抗菌剂单质碘后的CGH-I2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果明显增强。

3 结 论

改性得到了壳聚糖双胍盐酸盐，利用其正电荷对体积大、易变形的碘分子有强吸引作用，得到络合碘壳聚糖双胍盐酸盐。XRD 分析表明：CGH 破坏了壳聚糖分子内的氢键，使其结晶性受到破坏，导致衍射峰强度减弱。TG、DTG 分析表明：CTS、CGH 的降解分为两个阶段，且其最大热分解速率分别出现在311.6℃和230.2℃。碘含量分析表明：当碘乙醇溶液浓度为0.02mol/L 时，壳聚糖双胍盐酸盐吸附碘量最大，其质量比为m ( CGH )∶m ( I2) = 1∶0. 46。通过抑菌试验，证实络合碘壳聚糖双胍盐酸盐对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌环直径分别为(18±1)mm 和(21±1)mm，敏感度均为高度 敏感。

[1] 周景润，辛梅华，李明春. 壳聚糖季铵盐的制备及其应用研究进展[J]. 化工进展，2008，27（5）：679-686.

[2] 赛明泽，图布新，唐阳，等. 改性壳聚糖加碘膜的制备与表征[J]. 精细化工，2014，31（1）：17-20.

[3] Nadia A Mohamed，Riham R Mohamed，Rania S Seoudi. Synthesis and characterization of some novel antimicrobial thiosemicarbazone O-carboxymethyl chitosan derivatives[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2014，63（2）：163-169.

[4] Wang Qun，Zhang Na，Hu Xianwen，et al. Chitosan / polyethylene glycol blend fibers and their properties for drug controlled release[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A，2008，85A（4）：881-887.

[5] Zhong Zhimei，Aotegen Bayaer，Xu Hui，et al. The influence of chemical structure on the antimicrobial activities of thiosemicarbazone-chitosan[J]. Cellulose，2014，21（1）：105-114.

[6] Dilamian M，Montazer M，Masoumi J. Antimicrobial electrospun membranes of chitosan/poly(ethylene oxide) incorporating poly(hexamethylene biguanide) hydrochloride[J]. Carbohydrate Polymers，2013，94（1）：364-371.

[7] 祝二斌，辛梅华，李明春，等. 壳聚糖/聚乙烯醇共混膜的氢键和相容性[J]. 化工进展，2012，31（5）：1082-1087.

[8] Mourya V K，Nazma N Inamdar. Chitosan-modifications and applications ： Opportunities galore[J]. Reactive & Functional Polymers，2008，6（68）：1013-1051.

[9] Dong Anjie，Feng Menghuang，Qi Haiying，et al. Synthesis and properties of O-carboxymethyl chitosan/poly(ethylene glycol) graft copolymers[J]. Journal of Materials Science：Materials in Medicine，2008，2（19）：869-876.

[10] Raafat Dina，Sahl Hans-Georg. Chitosan and its antimicrobial potential——A critical literature survey[J]. Microbial Biotechnology，2009，2（2）：186-201.

[11] 赵雪，乔真真，何瑾馨，等. 壳聚糖双胍盐酸盐对羊毛织物抗菌性能的影响[J]. 毛纺科技，2009，37（10）：23-26.

[12] 丁德润，薄兰君，梁爱斌. 壳聚糖及其衍生物与碘的络合物的抑菌性质研究[J]. 精细化工，2006，23（9）：903-906.

[13] 丁德润，司晓伟，姚有红. 季铵化两亲性壳聚糖衍生物载药性质[J]. 精细化工，2012，29（6）：549-553.

[14] Sai Mingze，Zhong Shiling，Tang Yang，et al. Research on the preparation and antibacterial properties of 2-N-thiosemicarbazide-6- O-hydroxypropyl chitosan membranes with iodine[J]. Journal of Applied Polymer Science，2014，131 （15），DOI：10.1002/app.40535.

[15] Zhao Xue，He Jinxin，Zhan Yizhen. Synthesis and characterization of chitosan biguanidine hydrochloride under microwave irradiation[J]. Polymer Journal，2009，41（12）：1031-1035.

[16] 邓俊，李明春，辛梅华，等. a-酮戊二酸修饰壳聚糖微球对牛血清蛋白的吸附[J]. 化工进展，2008，27（12）：1991-1995.

[17] Hana Přichystalová，Numan Almonasy，Abdel-Mohsen A M，et al. Synthesis ， characterization and antibacterial activity of new fluorescent chitosan derivatives[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2014，65（4）：234-240.

[18] Rodríguez-Núñez Jesús R，López-Cervantes Jaime，Sánchez- Machado Dalia I，et al. Antimicrobial activity of chitosan-based films against Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus[J]. International Journal of Food Science＆Technology，2012，47（10）：2127-2133.