新疆汉族和哈萨克族儿童维生素D受体基因多态性与超重或肥胖的关系研究

王红清，徐佩茹，李 敏，刘新彩，周广花

肥胖是引发机体发生高血压、心脑血管疾病、糖尿病等多种慢性疾病的主要诱因［1］，尤其是儿童时期的肥胖很有可能延续至成人阶段，而且始于儿童时期的肥胖比成人后肥胖的人群更易患各种慢性疾病［2-3］。因此，儿童肥胖已成为公共卫生领域的研究热点。目前多项研究显示，维生素D水平与肥胖显著相关［4-6］。但关于维生素D受体 (VDR)基因多态性与肥胖的关系国内外研究甚少且结论不一致。本研究对新疆伊犁地区汉族和哈萨克族学龄儿童VDR基因ApaⅠ(A/C)(rs7975232)、BsmⅠ (C/T)(rs1544410)位点多态性进行分析，旨在探讨VDR基因ApaⅠ、BsmⅠ位点多态性与汉族、哈萨克族学龄儿童超重/肥胖的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2009年5—6月在新疆伊犁哈萨克自治州各县、市、乡采用整群抽样的方法，抽取8所小学中7～12岁超重/肥胖学龄儿童250例为病例组，其中汉族127例 (女47例，男80例)，哈萨克族123例 (女48例，男75例);选取同时期年龄、性别与病例组匹配的非超重/肥胖健康学龄儿童255例为对照组，其中汉族131例 (女44例，男87例)，哈萨克族124例 (女52例，男72例)。两组均排除由代谢、内分泌、遗传及中枢神经系统等疾病所致肥胖及肥胖综合征。家属均签署知情同意书，本研究得到医院伦理委员会批准。采用体质量低于同年龄、同性别的第85百分位为健康学龄儿童，超过同年龄、同性别的第85百分位为超重/肥胖学龄儿童［7］。

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA提取 按经典酚-氯仿-异戊醇法从血白细胞中提取基因组DNA，用可见紫外分光光度计检测基因组DNA的浓度和纯度，置-20℃冰箱冷冻保存，用作PCR反应模板。

1.2.2 引物设计与合成 (1)ApaⅠ位点上游引物:5'-AAGGAGAGGCAGCGGTACT-3'，下游引物:5'-CCGGTCAGTCATAGAGG-3'〔由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成〕;(2)BsmⅠ位点:参照文献 ［8］，上游引物:5'-CAACAAAGACTACAAGTACCGCGTCAGT GA-3'，下游引物:5'-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGG G-3'〔由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成〕。

1.2.3 PCR 反应 PCR 25 μl反应体系:模板 DNA 3 μl，重 蒸 水 (ddH2O)8.5 μl，2 × Apa Master MIX 12.5 μl〔生工生物工程 (上海)股份有限公司〕，上游引物与下游引物各0.5 μl。PCR反应条件:94℃预变性3 min，35个循环〔95℃变性 30 s，62℃退火(ApaⅠ)、56℃退火 (BsmⅠ)30 s，72℃延伸1 min〕，72℃延伸5 min后，用PCR扩增仪扩增，PCR片段长度为329 bp(ApaⅠ)、822 bp(BsmⅠ)。PCR反应产物经由 1.5%(ApaⅠ)、1.0%(BsmⅠ)琼脂糖凝胶电泳，100 V恒压电泳25 min，利用紫外线凝胶成像系统检测扩增结果并照相记录。

1.2.4 酶切 取 PCR产物5 μl，加入限制性内切酶0.5 μl(Thermo 公 司)、10 × 缓 冲 液 2 μl，ddH2O 8.5 μl，混匀后置65 ℃酶解 30 min(ApaⅠ)、37 ℃酶解过夜 (BsmⅠ)。反应产物以PCR Markers〔生工生物工程 (上海)股份有限公司〕作为DNA片段的标准对照物，PCR 酶 解 产 物 由 2.0% (ApaⅠ)、1.5%(BsmⅠ)琼脂糖凝胶，溴化乙啶染色，于100 V恒压电泳25 min，利用紫外线凝胶成像系统检测并照相记录，判读基因型。

1.2.5 基因型判定 ApaⅠ位点:纯合子基因型 (aa)出现88 bp、241 bp 2条带，杂合子基因型 (Aa)出现329 bp、241 bp、88 bp 3条带，纯合子基因型 (AA)仅出现329 bp 1条带 (见图1);BsmⅠ位点:纯合子基因型 (bb)出现646 bp、176 bp 2条带，杂合子基因型(Bb)出现822 bp、646 bp、176 bp 3条带，纯合子基因型 (BB)仅出现822 bp 1条带 (见图2)。

1.2.6 基因测序 选取部分标本的PCR产物送至华大生物工程技术服务有限公司进行测序，进一步验证扩增目的片段酶切后的分型是否正确，部分测序结果见图3、4。

1.3 质量控制 调查人员均为儿科专业，经过培训和上岗考核，调查仪器均经过校正;随机抽取10%的样本，重复检测基因型;选取部分标本的PCR产物进行测序，验证扩增目的片段酶切后的分型是否正确。

图1 ApaⅠ位点多态性电泳图Figure 1 Electrophoretogram for ApaⅠpolymorphism

本研究创新点:

多项研究结果表明，新疆哈萨克族人群是肥胖的高发人群，推测认为可能与特定的遗传因素相关。本研究以新疆伊犁地区7～12岁汉族和哈萨克族学龄儿童为研究对象，采用病例对照研究方法，运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测汉族、哈萨克族学龄儿童维生素D受体 (VDR)基因ApaⅠ、BsmⅠ位点基因型分布情况及等位基因频率，并比较两民族ApaⅠ、BsmⅠ位点基因型分布及等位基因频率的差异，不仅丰富了不同民族VDR基因的遗传学资源库，而且判别了VDR基因是否是汉族、哈萨克族学龄儿童新的肥胖易患基因。从基因学方面对汉族、哈萨克族超重/肥胖学龄儿童进行研究，可明确两族肥胖遗传因素是否存在异质性，且对两族儿童肥胖的易患性起到预示作用，进而为两族儿童肥胖的防治提供分子遗传学线索，具有积极的促进作用。

图2 BsmⅠ位点多态性电泳图Figure 2 Electrophoretogram for BsmⅠpolymorphism

图3 Aa基因型测序图Figure 3 Sequencing diagram of the Aa genotype

图4 Bb基因型测序图Figure 4 Sequencing diagram of the Bb genotype

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，Hardy-Weinberg遗传平衡检验采用χ2检验;两组民族、性别构成及基因型分布、等位基因频率比较采用χ2检验;计量资料以 (±s)表示，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 对照组与病例组汉族和哈萨克族儿童性别、年龄比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表1)。

表1 对照组与病例组儿童一般资料比较Table 1 Comparison of general characteristics between control group and case group

2.3 汉族与哈萨克族健康学龄儿童ApaⅠ、BsmⅠ位点基因型分布及等位基因频率比较 汉族与哈萨克族健康学龄儿童ApaⅠ位点基因型分布及等位基因频率比较，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表2)。

汉族与哈萨克族健康学龄儿童BsmⅠ位点基因型分布及等位基因频率比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05，见表 3)。

2.4 对照组与病例组儿童ApaⅠ、BsmⅠ位点基因型分布及等位基因频率比较 对照组与病例组汉族儿童ApaⅠ位点基因型分布比较，差异无统计学意义 (P＜0.05)，等位基因频率比较，差异有统计学意义 (P＜0.05);对照组与病例组哈萨克族儿童ApaⅠ位点基因型分布及等位基因频率比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表 4)。

对照组与病例组汉族及哈萨克族儿童BsmⅠ位点基因型分布及等位基因频率比较，差异均无统计学意义(P＞0.05，见表5)。

2.5 对照组与病例组汉族及哈萨克族儿童两位点突变情况比较 对照组与病例组汉族儿童两位点突变情况比较，差异均无统计学意义 (χ2=3.73，P=0.15，见表6);对照组与病例组哈萨克族儿童两位点突变情况比较，差异均无统计学意义 (χ2=0.29，P=0.96，见表7)。

表2 汉族与哈萨克族健康学龄儿童ApaⅠ位点基因型分布及等位基因频率比较〔n(%)〕Table 2 Comparison of distribution of ApaⅠgenotype and allele gene frequency between Han healthy school-aged children and Kazakh healthy school-aged children

表3 汉族与哈萨克族健康学龄儿童BsmⅠ位点基因型分布及等位基因频率比较〔n(%)〕Table 3 Comparison of distribution of BsmⅠgenotype and allele gene frequency between Han healthy school-aged children and Kazakh healthy school-aged children

表4 对照组与病例组儿童ApaⅠ位点基因型分布及等位基因频率比较〔n(%)〕Table 4 Comparison of distribution of ApaⅠgenotype and allele gene frequency between control group and case group

表5 对照组与病例组儿童BsmⅠ位点基因型分布及等位基因频率比较〔n(%)〕Table 5 Comparison of distribution of BsmⅠgenotype and allele gene frequency between control group and case group

表6 对照组与病例组汉族儿童两位点突变情况比较 (例)Table 6 Comparison of the mutation of ApaⅠ and BsmⅠ among Han children between control group and case group

表7 对照组与病例组哈萨克族儿童两位点突变情况比较 (例)Table 7 Comparison of the mutation of ApaⅠ and BsmⅠ among Kazakh children between control group and case group

3 讨论

Wong等［9-10］通过敲除VDR基因野生型小鼠，结果显示，基因敲除小鼠的耗氧量和CO2产生量均明显高于野生型小鼠，体内能量消耗减少，诱导肥胖的发生。进一步研究发现，VDR通过调节解偶联蛋白 (UCP)的表达来抑制前脂肪细胞分化为脂肪细胞，可减少脂肪的生成，从而抑制肥胖的发生［11］。但目前关于人类VDR基因与肥胖易患性的研究较少，且在不同的人群研究中尚未得出统一的结论。Vimaleswaran等［12］通过研究5 224例45岁英国人群BMI与VDR间的关联性，共选取VDR的26个单核苷酸多态性 (SNPs)，结果提示，VDR基因不太可能是引起英国成人肥胖发生的主要基因。但对同样属于欧洲的法国人来说，TaqⅠ位点的TT基因型和BsmⅠ位点的bb基因型与其他基因型人群相比，BMI增加了4 kg/m2(或体质量增加了9 kg)，使肥胖发生率增加了30%［13］。波兰学者以351例50～60岁绝经后健康妇女为研究对象，结果显示，BsmⅠ位点与BMI间无明显相关性［14］。但对绝经前健康美国妇女的研究发现，BsmⅠ位点的bb基因型与体质量增加有关［13］。对瑞典绝经前的健康妇女和法国儿童研究也同样发现，BsmⅠ位点的bb基因型与脂肪量和体质量增加有关［13］。以上研究说明，在欧洲人群中VDR基因多态性与BMI或肥胖间的关联研究存在差异。同样在亚洲和非洲也得到相似的结论。Al-Daghri等［15］通过研究402例肥胖 (BMI≥30 kg/m2)和489例健康 (BMI＜30 kg/m2)沙特阿拉伯儿童人群，结果显示，TaqⅠ和BsmⅠ位点与肥胖具有相关性，ApaⅠ与肥胖无明显相关性，但ApaⅠ与TaqⅠ、BsmⅠ组成的单倍体GTA和ACC与肥胖具有相关性。但在Al-Daghri等［16］的另外一项研究中，以沙特阿拉伯285例代谢综合征和285例健康对照人群为研究对象，结果显示，BsmⅠ位点B等位基因与肥胖相关，是肥胖的危险因素，但TaqⅠ、ApaⅠ、FokⅠ均与肥胖无相关性。Dorjgochoo等［17］以6 922例25～70岁上海女性为研究对象，结果显示，VDR基因与BMI间无相关性。Xu等［18］通过研究260例中国健康绝经后妇女，结果显示，ApaⅠ位点与BMI具有相关性。上海学者以来自400个家庭的1 215例参与者为研究对象，发现ApaⅠ、FokⅠ与BMI间无明显相关性，尾型同源盒转录因子2(CDX-2)与BMI有关［19］。以上研究结果表明，VDR基因多态性与肥胖间的相关性，不仅存在位点差异，而且具有民族、地域、性别等差异。考虑到基因位点的突变率在不同年龄、民族、种族等均存在差异，同时东西方的生活方式及环境因素不同，所以为验证VDR基因多态性与肥胖的相关性，有必要进行大规模、多地区的研究。

目前，关于人类VDR基因与肥胖的关系研究甚少且结论不统一，且研究对象多为成人，对儿童研究甚少。本研究以新疆伊犁地区7～12岁汉族和哈萨克族学龄儿童为研究对象，结果显示，汉族健康学龄儿童ApaⅠ位点a等位基因频率为68.3%，a为优势基因，与赵金秀等［20］、席卫平等［21］报道相近;哈萨克族属于高加索人种，A、a等位基因频率基本相等，与Riggs等［22］研究一致;汉族健康学龄儿童BsmⅠ位点分布不均衡，其中b等位基因占绝对优势，与赵江霞等［23］研究一致，汉族等位基因频率与韩国人的相似［24］，但低于白种人［25］。哈萨克族健康学龄儿童BsmⅠ位点多态性的分布以bb(62.9%)和Bb(35.5%)型为主，与陈瑞英等［26］研究结果 bb(47.0%)和 Bb(48.0%)不同，可能与不同研究的样本选择有关。这表明ApaⅠ、BsmⅠ位点多态性分布均有明显的种族差异。

本研究结果还显示，ApaⅠ位点的A、a等位基因在新疆伊犁地区病例组与对照组汉族学龄儿童间有差异，而两组哈萨克族学龄儿童间无差异，提示ApaⅠ位点可能与汉族学龄儿童超重/肥胖有关，而与哈萨克族学龄儿童超重/肥胖无关。Al-Daghri等［15］研究沙特阿拉伯成人人群，结果显示，ApaⅠ位点与肥胖无相关性，但与其TaqⅠ、BsmⅠ位点组成的单倍体GTA和ACC与肥胖有关。Xu等［18］与 Binh等［8］均通过研究绝经后健康妇女显示，ApaⅠ位点与BMI具有相关性。在沙特阿拉伯成人人群，BsmⅠ位点与肥胖具有相关性，等位基因B是肥胖的危险因素，且与TaqⅠ、BsmⅠ位点组成的单倍体ACC和GTA均与肥胖有关［14-15］。以健康妇女为研究对象，发现BsmⅠ位点的bb基因型与体质量增加有关［13］。对瑞典绝经前健康妇女、法国儿童的研究也同样发现，BsmⅠ位点的bb基因型与脂肪量和体质量增加有关［13］。但同样以健康妇女为研究对象，波兰学者研究显示，BsmⅠ位点与BMI无相关性［27］。同时，本研究还发现，两位点的交互作用与汉族、哈萨克族超重/肥胖学龄儿童亦无相关性。但在法国高加索人群的研究发现，VDR基因TaqⅠ位点TT基因型和BsmⅠ位点bb基因型间的交互作用与其他基因型组合的人群相比，体质量增加了9 kg(或BMI增加了4 kg/m2)，且增加了30%的肥胖发生率［28］。

以上研究结果表明，关于VDR基因多态性与超重/肥胖间的相关性研究，国内外的学者研究结论不一致，有些甚至相互矛盾，出现上述现象的原因可能是:(1)样本的来源不同:不同民族、不同人种间具有明显遗传异质性，从人种学分类来说，汉族、日本和韩国属于蒙古人种，哈萨克族、维吾尔族和欧美国家同属高加索人种;(2)肥胖与基因的相关性研究存在诸多混杂因素，如群体的分层现象是一个极其重要但又常被忽视的混杂因素，同时环境因素也不可忽视，而环境因素的差异，致使遗传因素与环境因素间的相互作用使肥胖病因的研究更加复杂;(3)不同年龄段的人群遗传负荷不同，随着年龄的增长，遗传因素对肥胖的影响逐渐减弱，而环境因素对肥胖的影响逐渐增强。因此，在不同地区、不同人种人群，甚至是不同年龄段中进行大样本多基因的研究，比较不同地区、不同人种、不同年龄段的遗传学因素非常重要。肥胖是由多个微效基因相互作用的慢性代谢性疾病，其发生和发展并不是简单的遵从孟德尔遗传模式，而是由多个基因参与，受多种因素相互影响的结果。一般来说，单个基因位点可能对肥胖的影响较小，而多个基因位点的联合作用却能显著放大这种作用。

本研究不足:(1)PCR-RFLP方法难以发现低频率、高外显但可能具有较强易患性的基因位点，这些变异位点可能比目前发现的变异位点的效应更强。因此，需要利用基因定位或测序方法来识别这些重要的变异基因位点;(2)本研究对象仅为新疆伊犁地区汉族、哈萨克族7～12岁学龄儿童群体，未涉及居住于当地的其他民族及其他地区的同龄儿童;且由于样本量的限制，未进行肥胖分度分析。作为基因多态性的相关性研究，研究结果不能推广到整个人群，研究尚显不足;(3)本研究为病例对照研究，选择性偏倚难以避免，混杂因素也不能完全排除，可能会夸大或者削弱基因与疾病之间的关联强度。今后本课题组将继续致力于新疆学龄儿童肥胖的多基因位点及多因素的研究，为进一步探讨学龄儿童肥胖的作用机制提供一定的理论基础。

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