葡萄籽提取物对医院临床分离菌株的抑菌作用及毒性试验分析*

冯春婷 孟姿秀 孟凡戈 李志富 胡作林 邵 伟

(1.泰山医学院，山东泰安271016;2.泰安市疾病预防控制中心，山东泰安271000; 3.山东大学药学院，山东济南250012)

葡萄籽提取物对医院临床分离菌株的抑菌作用及毒性试验分析*

冯春婷1孟姿秀1孟凡戈1李志富1胡作林2邵 伟3

(1.泰山医学院，山东泰安271016;2.泰安市疾病预防控制中心，山东泰安271000; 3.山东大学药学院，山东济南250012)

目的分析葡萄籽乙醇提取液对医院临床分离菌株的体外抑菌作用和毒性。方法以临床标本分离菌株为对象，采用抑菌环试验和营养肉汤稀释法对其抑菌效果进行了试验观察;采用动物试验对其进行了毒性试验观察。结果含葡萄籽生药125 g/L的乙醇提取液对临床分离菌株和标准菌株的抑菌环直径均大于7 mm。葡萄籽乙醇提取物对白色念球菌的最低抑菌浓度(MIC)为25.0 g/L。小鼠急性经口LD50值大于5000mg/kg，葡萄籽提取原液对家兔皮肤刺激试验指数为0.13，属于轻度刺激性。结论葡萄籽乙醇提取液具有良好的抑菌作用，属无毒、低刺激性物质。

葡萄籽乙醇提取液;抑菌作用;临床分离菌株;标准菌株

葡萄籽为葡萄果实成熟后剥离果肉所收集的内核物质，洗净，晒干。葡萄籽为性状不规则的颗粒状，大小不一。外表面红棕色、棕黄色或暗棕色，质硬而脆，断面白色。无臭，味苦涩。据有关文献报道［1］，葡萄籽中主要含有一种叫葡多酚的物质(也称花青素)，该物质是迄今发现的植物来源中最高效的抗氧化剂之一，体内和体外试验表明，葡萄籽提取物的抗氧化效果，比维他命E强50倍，比维他命C强20倍，超强的抗氧化效率具有清除自由基、提高人体免疫力的强力效果。另外葡萄籽中还含有白藜芦醇、葡萄籽素、单宁、异槲皮甙、甘露醇及类黄酮等生物活性物质。目前，人们对葡萄籽提取物在临床上的抗氧化作用研究的比较多，而对于其在杀菌抑菌方面的研究报道较少，特别是对医院临床分离菌株的抑菌作用和效果尚未见到相关报道。为了解葡萄籽的乙醇提取物对医院常见分离菌的抑菌作用和毒性，在实验室对葡萄籽乙醇提取物对临床分离菌株和标准菌株的抑菌效果、动物急性毒性及稳定性进行了观察分析。现将结果报告如下。

1 方法

1.1葡萄籽提取液的制备取晒干后的葡萄籽，用无菌蒸馏水洗净晾干后碾碎，去除表皮，剩下的葡萄籽按照1∶25的固液比例加入70%乙醇溶液浸泡过夜，对浸泡后的溶液超声提取50 min。然后将溶液经4000 r/min进行离心分离，将分离后的溶液进行减压浓缩制成含生药为350 g/L的提取原液。试验时可用无菌蒸馏水稀释成不同体积比的稀释液备用。

1.2细菌悬液的制备［2］取白色念球菌(ATCC10231)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、枯草杆菌黑色变种(ATCC9372)等标准菌株和结核分枝杆菌、肺炎链球菌、蜡状芽胞杆菌、变形杆菌、肠球菌、肺炎克雷伯氏菌等临床分离菌株的24 h新鲜斜面培养物。分别用5ml胰蛋白胨生理盐水(TPS)将菌苔洗下并稀释成含菌量为105～106cfu/ml的菌悬液。

1.3菌片的制备［3］将定性滤纸制成5 mm直径的圆片，经过压力蒸汽灭菌处理，干燥保存备用。取处理好的滤纸片放入无菌平面皿内，每4层滤纸片滴加含生药量为125 g/L的葡萄籽乙醇提取液30 μl;阴性对照样片滴加30 μl生理盐水，置无菌室晾干备用。

1.4纸片法抑菌试验将各菌悬液分别取0.2ml均匀涂抹于各种试验菌所需固体培养基平板上，将直径为5 mm灭菌的滤纸片蘸取不同浓度葡萄籽乙醇稀释液，37℃干燥;然后分别贴放于上述染菌琼脂平板表面，置37℃培养24 h，观察结果。用数显游标卡尺测量抑菌环的直径，并记录测量数据。试验重复6次。若抑菌环直径大于7 mm者为有抑菌作用;小于或等于7 mm者判为无抑菌作用。6次重复试验均达到有抑菌作用结果者判为合格。阴性对照组应无抑菌环产生，否则试验无效。

1.5最小抑菌浓度测定用蒸馏水将葡萄籽乙醇提取液进行系列对倍稀释，分别取个稀释度药液2.5ml加入到含有2.5ml双倍浓度营养肉汤的试管中;然后再每管加入0.1ml试验菌悬液混和均匀;在不含药液的营养肉汤试管中加入0.1ml菌悬液，作为阳性对照组。将各接种管置于37℃培养箱中培养48 h，观察结果。结果判断，纸片法试验以阴性对照纸片无抑菌环，浸药纸片抑菌环大于7 mm，即判定有抑菌作用，抑菌环越大效果越好;最低抑菌浓度测定结果，在阳性对照管有菌生长和阴性对照管无菌生长的条件下，以试验组管无菌生长的最低稀释度为MIC。

1.6毒性试验

1.6.1小鼠急性经口毒性试验取30只小鼠(昆明种，山东大学试验动物中心提供，试验动物许可证号SCXK(鲁)20030004)体重18～22 g，雌雄各半，随机分成3组。染毒前，禁食过夜(不限制饮水)。将葡萄籽乙醇提取药液原液、原液用无菌蒸馏水稀释1倍、原液用无菌蒸馏水稀释2倍对应的3个不同浓度组溶液，采用一次经口灌胃染毒法，灌胃量均为0.1ml/10g(体重)。染毒后，连续观察14 d小鼠的中毒表现和死亡情况，根据小鼠死亡情况，按概率单位－对数图解法求出半数致死量(LD50)［4］，并确定急性毒性分级。

1.6.2一次完整皮肤刺激试验取健康成年的新西兰白色家兔3只(山东大学试验动物中心提供，试验动物许可证号SCXK(鲁)20030004)，体重2.5～2.7 kg，剪去脊柱两侧的毛，去毛面积两侧各为3 cm×3 cm，24 h后确认无皮肤损伤后，将0.2ml的葡萄籽乙醇提取原液直接敷贴在去毛区的兔背一侧皮肤上，然后用两层纱布和一层玻璃纸覆盖，无刺激胶布固定，另一侧皮肤作为空白对照。固定4 h后用温水洗去残留物，观察去除受试物后的24 h、48 h的皮肤刺激反应，计算原发刺激指数，做出评价［5］。

1.7稳定性试验将葡萄籽提取原液密封于无菌玻璃瓶中，置室温下存放14 d，于存放前后分别取3份样品稀释后测定其对白色念球菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌黑色变种的抑菌效果。

2 结果

2.1抑菌试验结果经检测，含葡萄籽生药125 g/ L浓度浸试纸片，在营养琼脂平板上白色念球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌黑色变种、结核分枝杆菌、肺炎链球菌、蜡状芽胞杆菌、变形杆菌、肠球菌、肺炎克雷伯氏菌等细菌的抑菌环直径均大于7 mm，显示出很好的抑菌效果(表1)。

最低抑菌浓度测定结果表明，以白色念球菌和肺炎链球菌对葡萄籽乙醇提取物最为敏感，而变形杆菌和肺炎克雷伯菌对其抗力最强(表2);最低抑菌浓度试验结果见表3。

表1 葡萄籽乙醇提取物对细菌的抑菌作用效果

表2 葡萄籽乙醇提取物抑菌作用

表3 葡萄籽乙醇提取物最低抑菌浓度试验结果

结果表明，白色念球菌抑菌浓度最低，而抗力最强者与表2结果一致。

2.2毒性试验结果毒性评价结果表明，小鼠急性经口毒性试验过程中，动物均无不良反应，也无动物死亡，LD50均大于5000mg/kg，属于无毒类提取液。

一次性皮肤刺激试验结果表明，葡萄籽乙醇提取原液作为受试物，对家兔皮肤刺激强度值为0.13，属于轻度刺激性。

2.3稳定性试验结果葡萄籽乙醇提取原液于室温下密封存放14 d，对白色念球菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌黑色变种抑菌效果有所下降，说明该提取液不宜长期储存。

3 讨论

葡萄籽是一种天然的植物抑菌物质，葡萄籽中起到抑菌作用的成分主要是葡多酚、白藜芦醇、葡萄籽素、单宁、异槲皮甙、甘露醇及类黄酮等生物活性物质。试验结果表明，葡萄籽生药125 g/L的乙醇提取液对白色念球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌黑色变种、结核分枝杆菌、肺炎链球菌、蜡状芽胞杆菌、变形杆菌、肠球菌、肺炎克雷伯氏菌等细菌的抑菌环直径均大于7 mm。葡萄籽乙醇提取物对白色念球菌的最低抑菌浓度(MIC)为25.0 g/L。小鼠急性经口LD50值大于5000mg/kg，属于无毒物质，以葡萄籽提取原液对家兔皮肤刺激试验指数为0.13，属于轻度刺激性。葡萄籽的化学成分很多，其药理作用与它的有效成分有关。随着对葡萄籽功能研究的日益深入，对葡萄籽的认识和利用会有进一步的提高，现代医学对葡萄籽生物活性物质的提取及药理作用亦会有更深入的研究，应该把传统的中医理论和葡萄籽现代的研究成果结合起来，利用高科技手段，研制高效产品。

［1］李家泰.临床药理学［M］.北京:人民卫生出版社，1999:516－592.

［2］卫生部卫生法制与监督司.消毒技术规范［S］.北京:中华人民共和国卫生部，2002:124.

［3］王桂亭，王嗥，宋艳艳，等.无花果叶提取物抑菌作用的实验研究［J］.中国消毒学杂志，2005，22(4):374.

［4］刘德生，李志富.环境监测［M］.北京:化学工业出版社，2001: 140－141.

［5］李志富，邵伟，任少红，等.一元制剂二氧化氯消毒粉剂杀菌性能及毒性试验研究［J］.中国消毒学杂志，2006;23(3):107.

Experimental analysis on bacteriostatic efficacy and toxicity of grape seeds extract in hospital clinically isolated strain

FENG Chun-ting1MENG Zi-xiu1MENG Fan-ge1LI Zhi-fu1HU Zuo-lin2SHAO Wei3
(1.Taishan Medical College，Taian 271016;2 Taian Centre for Disease Control and Prevention，Taian 271000; 3.College of Pharmacy，Shandong University，Jinan 250012，China)

Objective:To analyze the bacteriostatic efficacy and toxicity of grape seeds ethanol extract in hospital clinically isolated strain.Methods:Clinically isolated strain specimens were used to observe the bacteriostatic efficacy of grape seed ethanol extract via bacterial inhibition zone test and nutrient broth method;and animal test was employed to observe experimentally its toxicity.Results:The diameters of bacterial inhibition zones of clinically isolated microorganism strain and standard microorganism strain exposed to the ethanol containing grape seed crude drug 125mg/L were larger than 7 mm.The minimum inhibition concentration(MIC)of grape seed ethanol extract for C albicans was 25.0mg/ml.The mouse acute oral LD50was above 5000mg/kg，the rabbit skin irritation test index of grape seed stock solution was 0.13，which belonged to mild irritation.Conclusion:Grape seed extract has good bacteriostatic efficacy and it belongs to practically non-toxic class and was slightly irritative to skin.

grape seed ethanol extract;bacteriostatic efficacy;clinically isolated strain;standard microorganism strain

R961

A文献标识码:1004-7115(2015)11-1225-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.11.008

2015-03-18)

教育部2014年大学生创新创业训练计划项目(201410439009)。

冯春婷(1993－)，女，泰山医学院在校学生。

李志富，E-mail:zfli@tsmc.edu.cn。