芩丹颗粒对微波辐射小鼠心脏损伤的防护作用

朱文赫，钟秀宏，徐俊杰，张红，吕士杰

（吉林医药学院生物化学教研室，吉林吉林132013)

芩丹颗粒对微波辐射小鼠心脏损伤的防护作用

朱文赫，钟秀宏，徐俊杰，张红，吕士杰

（吉林医药学院生物化学教研室，吉林吉林132013)

目的探讨芩丹颗粒对微波辐射小鼠心脏损伤的防护作用。方法60只小鼠随机分为正常对照组、100 mW·cm-2辐射损伤组、辐射损伤+芩丹颗粒2.5，5.0和10.0 g·kg-1防护组。芩丹颗粒防护组小鼠于辐射前7 d每天ig给药1次。辐射后6 h，取静脉血，用生化法检测血清谷草转氨酶（GOT）、乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）活性。取心肌组织，用比色法检测三磷酸腺苷（ATP）含量、线粒体呼吸链复合体Ⅳ和Ⅴ活性，用光镜和电镜观察心肌组织结构的变化，用Western蛋白印迹法检测细胞色素c（Cyt c）和激活型胱天蛋白酶3表达的变化。结果与正常对照组比较，微波辐射组小鼠心肌细胞水肿、线粒体数量减少且形态异常，血清中GOT，CK和LDH活性升高（P＜0.01），线粒体呼吸链复合体Ⅳ和Ⅴ活性显著下降（P＜0.01），心肌细胞Cyt c和激活型胱天蛋白酶3蛋白表达显著升高（P＜0.01）。与辐射损伤组比较，芩丹颗粒5.0和10.0 g·kg-1防护组小鼠心肌细胞体积正常，细胞核和细胞器形态完好，心肌细胞结构损伤程度显著缓解；心肌组织ATP含量、线粒体呼吸链复合体Ⅳ和Ⅴ活性均显著升高（P＜0.01）；心肌细胞Cyt c和激活型胱天蛋白酶3蛋白表达均显著下降（P＜0.01）。结论芩丹颗粒对微波辐射致小鼠心肌细胞损伤具有一定的防护作用，其机制可能与其改善微波所致心肌细胞能量代谢有关。

微波辐射；芩丹颗粒；ATP；线粒体呼吸链

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2015.04.005

微波已经广泛应用于工农业、通讯、电视、医疗和军事等各个领域，其在给人们带来极大益处的同时，所引起的广泛的生物学损伤效应也越来越受到重视［1］。已有的研究表明，心脏是微波辐射敏感的靶器官之一，微波辐射可造成心肌细胞形态结构和功能的损伤［2-4］。心脏是循环系统的动力器官，其结构和功能的异常将影响机体血液供应，对全身各系统器官造成不良影响。氟伐他汀、丹参、参麦注射液、安多霖胶囊、抗辐灵胶囊和白细胞介素3等药物虽然能减轻辐射对机体的损伤，但目前未见能够有效防治微波辐射致心脏损伤的药物［5］。

中药方剂具有副作用小、可从整体水平提高身体机体功能的特点，在微波防治药物极其缺乏的情况下，研发可用于防治微波辐射致心脏损伤的中药方剂是可行而且是必要的。芩丹颗粒具有清热凉血、滋阴生津和扶正固本功效。本研究旨在探讨芩丹颗粒对微波辐射致小鼠心脏损伤的防护作用，为其今后在微波辐射防护方面的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

线粒体呼吸链复合体Ⅳ和Ⅴ及ATP试剂盒购于上海杰美基因医药科技有限公司；谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，GOT）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和肌酸肌酶（creatine kinase，CK）活性测定试剂盒购于南京建成生物工程研究；兔抗人细胞色素c（cytochrome c，Cyt c）、激活型胱天蛋白酶3（cleaved caspase 3）和β肌动蛋白抗体购于Santa cruz公司；山羊抗兔IgG二抗购于武汉博士德生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。MY8C-1型微波辐射仪，南京汇研微波系统工程有限公司，频率为2450 MHz；550酶标仪，美国Bio-Rad公司；MTN-658A生化分析仪，长春市曼特诺医疗器械有限公司。

1.2 芩丹颗粒的研制

芩丹颗粒由本实验室自行研制，由黄芩25 g，麦冬25 g，沙参20 g，栀子20 g，丹皮20 g和黄芪20 g等十几味中药材组成［6］。用HPLC法测定芩丹颗粒中黄芩苷、栀子苷和丹皮酚含量，对芩丹颗粒主要成分进行质量控制［7］。

1.3 动物和实验分组

清洁级BALB/c雄性小鼠60只，动物合格证号：SCXK-吉2008-0005，体质量16～18 g，由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供。实验分5组，正常对照组、100 mW·cm-2辐射损伤组、芩丹颗粒2.5，5.0和10.0 g·kg-1防护组，每组12只。将芩丹颗粒溶于蒸馏水中，4℃冰箱保存。防护组小鼠于辐射前7 d每天ig给药1次（20 mL·kg-1）。正常对照组和辐射损伤组每天给予等体积蒸馏水。末次给药12 h后，进行辐射处理。

1.4 微波辐射条件

小鼠置于自制有机玻璃盒内，加盖（有孔），小鼠在盒内为固定体位，背上腹下位，左侧胸部暴露于辐射场中，其余部位用微波防护材料屏蔽。辐射强度为100 mW·cm-2，辐射时间为6 min，环境温度为19.5～20.5℃，相对湿度40%。微波辐射后6 h，用1%戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉。

1.5 生化指标及心肌组织ATP含量、线粒体呼吸链复合体Ⅳ和Ⅴ活性检测

腹主动脉取血，制备血清，应用生化检测仪检测血清中GOT，CK和LDH活性。

冰浴条件下取心肌组织，生理盐水冲洗，冰浴中充分研磨，800×g离心5 min，取上清液12 000×g离心10 min，沉淀为线粒体成分，用保存液悬浮沉淀，采用Bradford法［8］检测线粒体蛋白含量。利用磷钼酸比色法检测ATP含量、线粒体呼吸链复合体Ⅳ和Ⅴ活性，按照各试剂盒操作方法进行操作。

1.6 心肌组织病理学检查

微波辐射后，将小鼠麻醉，冰浴下立即取小鼠心脏心尖部位，固定于4%甲醛溶液中，常规石蜡包埋，切片，HE染色，在光镜下观察心肌组织病理变化。

1.7 心肌组织超微结构观察

微波辐射后，每组取6只小鼠心脏心尖心肌组织1 mm3，经2.5%的戊二醛和质量分数为0.01的锇酸固定后，丙酮梯度脱水、包埋，半薄切片定位，甲苯胺蓝染色观察病变部位并定位，然后超薄切片机制作超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，T20型透射电镜下观察，心肌组织超微结构观察结果采用盲法评估。

1.8 Western蛋白印迹法检测心肌组织Cyt c和激活型胱天蛋白酶3蛋白的表达

微波辐射后，取6只小鼠心脏，低温下将心脏组织剪碎，加入组织蛋白提取液，12 000×g离心10 min，收集上清。经BCA法进行蛋白定量后，每个点样孔加样20 μg蛋白样品液，以12%SDSPAGE进行电泳。电泳后将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后，兔抗人Cyt c（1∶500）、激活型胱天蛋白酶3（1∶500）和β肌动蛋白抗体（1∶1000）4℃育过夜，用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。分再以辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶1000）二抗封闭液孵育1 h。TBST溶液漂洗用ECL显影，扫描纪录。运用图像分析软件Quantity One分析条带的吸光度值，将对照组和药物组的目的条带的积分吸光度值和内参的积分吸光度值比值表示蛋白质相对表达水平。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 芩丹颗粒对微波辐射小鼠血清GOT，CK和LDH活性的影响

表1可见，与正常对照组相比，100 mW·cm-2辐射后6 h，小鼠血清中GOT，CK和LDH活性明显升高（P＜0.01）。与辐射损伤组相比，芩丹颗粒5.0和10.0 g·kg-1防护组小鼠血清中GOT，CK和LDH含量明显下降（P＜0.01）。表明微波辐射后，小鼠心肌细胞受损，芩丹颗粒对微波辐射所致小鼠心肌细胞损伤具有一定的防护作用。

Tab.1 Effect of Qindan granules on activity of glutamic oxalacetic transaminase（GOT），creatinekinase（CK）and lactate dehydrogenase（LDH）in serum of mice irradiated by microwave

2.2 芩丹颗粒对微波辐射小鼠心肌ATP含量和线粒体呼吸链复合体Ⅳ和Ⅴ活性的影响

表2可见，与正常对照组相比，100 mW·cm-2辐射后6 h，心肌组织中ATP含量、线粒体呼吸链复合体Ⅳ和Ⅴ活性明显降低（P＜0.01）。与辐射损伤组相比，芩丹颗粒5.0和10.0 g·kg-1防护组小鼠心肌组织ATP含量、线粒体呼吸链复合体Ⅳ和Ⅴ活性明显升高（P＜0.01）。表明微波辐射对小鼠心脏能量代谢具有明显的影响，芩丹颗粒对微波辐射所致小鼠心脏损伤具有一定的防护作用。

2.3 芩丹颗粒对微波辐射小鼠心肌组织结构的影响

由图1可见，正常对照组小鼠心肌细胞呈圆柱状，肌纤维平行排列，横纹清晰。细胞核椭圆形，位于细胞中央（图1 A）。辐射损伤组小鼠心肌细胞轻度水肿，肌纤维排列不整，横纹模糊不清（图1 B）。芩丹颗粒5.0和10.0 g·kg-1防护组小鼠心肌细胞水肿减轻明显，肌纤维排列较整齐，细胞核固缩现象明显减少（图1 D和E），表明芩丹颗粒对微波辐射小鼠心肌细胞损伤具有防护作用。

2.4 芩丹颗粒对微波辐射小鼠心肌组织超微结构的影响

由图2可见，正常对照组小鼠心肌细胞体积大小正常，细胞核染色质均匀分布，肌丝排列整齐，各带较明显，闰盘较完整。线粒体和糖原颗粒丰富，线粒体排列较为规则，呈圆形、椭圆形或长杆状，膜较完整，嵴清晰可见（图2A）。微波辐射模型组小鼠心肌细胞线粒体和肌丝排列不紧密，肌丝明暗带不清晰，肌丝溶解、断裂。线粒体数量减少且形态异常，部分线粒体溶解空化基质明显肿胀，内膜和外膜的完整性明显破坏（图2B）。而芩丹颗粒5.0和10.0 g·kg-1防护组小鼠肌细胞线粒体排列于肌丝束之间排列较规则、整齐，无肌丝溶解、断裂，线粒体结构较完整（图2 D和E）。

Tab.2 Effect of Qindan granules on content of ATP，activity mitochondrial complexesⅣandⅤin myocardial tissue of mice irradiated by microwave

Fig.1 Effect of Qindan granules on pathological changes of myocardial tissue of mice irradiated by microwave（HE staining，×200）.A：normal control group；B：radiation injury group；C，D and E：Qindan granules 2.5，5.0 and 10.0 g·kg-1protective group，respectively.Arrows show the pathological changes of mild edema,muscle fiber malalignment,blurred striation in myocardial cells

Fig.2 Effect of Qindan granules on ultrastructure changes in myocardial tissue of mice irradiated by microwave（Electron microscope×1000）.A：normal control group；B：radiation injury group；C，D and E：Qindan granules 2.5，5.0 and 10.0 g·kg-1protective groups，respectively.Arrows show that mitochondria and muscle filaments were not closely arranged and the mitochondrial matrix was obviously swollen.

2.5 芩丹颗粒对微波辐射小鼠心肌细胞激活型胱天蛋白酶3和Cyt c蛋白表达的影响

Western蛋白印迹实验结果显示（图3），与正常对照组比较，微波辐射模型组小鼠心肌组织匀浆中激活型胱天蛋白酶3和Cyt c蛋白表达显著升高（P＜0.01）。与辐射模型组比较，芩丹颗粒5.0和10.0 g·kg-1防护组激活型胱天蛋白酶3和Cyt c的表达显著下降（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of Qindan granules on protein expression of cleaved caspase 3（A）and cytochrome c（B）in myocardial tissue of mice irradiated by microwave. 1：normal control；2：radiation injury group；3，4 and 5：Qindan granules 2.5，5.0 and 10.0 g·kg-1protective group，respectively. A2 and B2 were the semiquantitativeresults of A1 and B1, respectively.IA:inntegrated absorbance.，＊＊P＜0.01，comparedwithnormalcontrolgroup；##P＜0.01，compared with radiation injury group.

3 讨论

心脏是微波辐射敏感的靶器官之一，微波对心脏的损伤有明显的剂量效应关系，但其规律仍未阐明［9］。研究表明，高功率微波照射对大鼠心肌组织的损伤程度存在剂量效应关系，功率密度越大，损伤越严重，病变出现越早，恢复越迟［10］。目前，对微波辐射致心脏损伤只能依靠物理方法及装备来达到防护目的，今后在加强物理方法防护同时，加大对辐射所致心脏损伤防治药物的研究具有重要的意义［11-12］。依据微波辐射损伤作用机制，结合中医药理论，我们研制出抗微波辐射损伤的中药复方制剂芩丹颗粒。本研究以小鼠为研究对象，从能量代谢和超微结构方面探讨芩丹颗粒在微波辐射所致小鼠心脏损伤的作用。

CK，GOT和LDH在心肌中含量较高，当心肌细胞受到损伤后，三者在血清中含量陡然增高，所以血清中GOT，CK和LDH的含量水平能敏感地反映心肌细胞受损程度［13］。心脏是个高耗氧、高耗能的器官，心肌组织唯一能直接利用的能量形式是ATP。心肌细胞具有高密度的线粒体分布，线粒体通过氧化磷酸化作用为细胞的各项活动提供能量［14］。因此，ATP酶活性的高低及线粒体功能是评价各种细胞能量代谢及功能有无损伤的重要指标。本研究结果表明，经强度为100 mW·cm-2微波辐射后，小鼠血清中GOT，CK和LDH含量明显升高，心肌酶发生紊乱；同时心肌组织中ATP含量和线粒体呼吸链复合体Ⅳ和Ⅴ活性明显下降。芩丹颗粒防护组小鼠血清中GOT，CK和LDH含量明显下降，心肌细胞的ATP含量及心脏组织中线粒体呼吸链复合体Ⅳ和Ⅴ活性明显升高。表明芩丹颗粒对微波辐射损伤小鼠心脏损伤及能量代谢具有一定的防护作用。心肌组织病理变化和超微结构的变化趋势与上述结果相符。

Cyt c是线粒体呼吸链中传递电子的载体，对线粒体能量代谢起重要的调节作用［15-16］。线粒体中的Cyt c除与细胞有氧活动有关外，还可激活和诱导细胞凋亡。Cyt c自线粒体释放至细胞浆为诱导细胞凋亡的重要环节，由线粒体释放Cyt c介导活化胱天蛋白酶3引起细胞凋亡［17］。Western蛋白印迹结果显示，微波辐射后胞浆Cyt c和激活型胱天蛋白酶3蛋白的表达量明显升高，说明微波辐射对心肌组织能量代谢具有影响，能够诱发损伤。而芩丹颗粒防护组Cyt c和激活型胱天蛋白酶3蛋白表达明显下降，表明其对微波所致的心肌细胞损伤具有防护作用，与上述研究结果相符。

综上，微波辐射可以导致心肌酶紊乱，引起ATP酶活性降低，破坏并消耗机体抗氧化物质，导致心肌细胞线粒体的损伤。芩丹颗粒对微波辐射损伤小鼠心脏具有防护作用，其机制可能与改善微波所致心肌细胞能量代谢损伤有关。具体的作用机制还有待深入研究。

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Protective effect of Qindan granules on mouse heart injury irradiated by microwave

ZHU Wen-he，ZHONG Xiu-hong，XU Jun-jie，ZHANG Hong，LYU Shi-jie
（Department of Biochemistry，Jilin Medical College，Jilin 132013，China）

OBJECTlVETo investigate the protective effect ofQindangranules on the heart of mice irradiated by microwave.METHODSSixty mice were randomly divided into 5 groups：normal control group，100 mW·cm-2microwave radiation injury group，andQindangranules 2.5，5 and 10 g·kg-1protective groups.Six hours after microwave irradiation，Qindangranules were ig given to the mice ofQindangranules protective groups once daily for 7 d.After 6 h of treatment，blood was collected.The activities of glutamic oxalacetic transaminase（GOT），lactate dehydrogenase（LDH）and creatine kinase（CK）in serum were detected by the biochemical method.The adenosine triphosphate（ATP）content and the activity of mitochondrial complexesⅣandⅤin heart tissue were measured by colorimetric method.The changes in tissue structure were observed by light microscopy and electron microscopy.The expression of cytochrome c（Cyt c）and cleaved caspase 3 was detected by Western blotting.RESULTSMyocardial cells developed edema.The number of mitochondria decreased while abnormal morphology，the content of GOT，CK and LDH increased in serum（P＜0.01）.The activity of ATP and mitochondrial complexesⅣandⅤdecreased significantly（P＜0.01）compared with normal control in cardiac tissue and myocardial cells were also injured.The expression of Cyt c and cleaved caspase 3 was increased in myocardial cells（P＜0.01）.Compared with microwave radiation group，the activity of ATP and mitochondrial complexesⅣandⅤincreased significantly inQindangranules 2.5，5 and 10 g·kg-1protective groups（P＜0.01）.The injured myocardial cells were improved and the structure of nuclei and organelles was normalized.The expression of Cyt c and cleaved caspase 3 was decreased（P＜0.01）.CONCLUSlONQindangranules has protective effect on microwave radiation induced injury in the mouse heart.The mechanism may be related to the improvement of energy metabolism of myocardium injured by microwave.

microwave radiation；Qindangranules；ATP；mitochondrial respiratory chain

The project supported by Science and Technology Development Project of Jilin Provincial Health Bureau（2012Z066）；and Project Agreement for Science＆Technology Development of Jilin Province（20140204002YY）

LYU Shi-jie，E-mail：jlmpczwh＠163.com

R285.5

A

1000-3002（2015）04-0559-06

2015-01-12接受日期：2015-07-26）

（本文编辑：齐春会）

吉林省卫生厅科技发展项目（2012Z066）；吉林省科技厅科技发展项目（20140204002YY）

朱文赫，男，博士，讲师，主要从事生物技术制药研究，E-mail:huolizwh＠163.com；吕士杰，男，硕士，教授，主要从事辐射损伤防治研究。

吕士杰，E-mail:jlmpczwh＠163.com