念珠状链杆菌Taqman MGB荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

邢 进，冯育芳，岳秉飞，贺争鸣，戴方伟，萨晓婴，代解杰

(1.中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 100050;2.浙江省医学科学院实验动物中心，杭州 310013;3.中国医学科学院医学生物学研究所，昆明 650118)

念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)是一种革兰氏阴性杆菌，作为重要的人兽共患病原［1］，可存在于各种正常鼠类或病鼠的口咽部、中耳及上呼吸道，具有高度多形性，在多种实验动物中都有发现，是人类鼠咬热(rat-bite fever)和哈佛山热(Haverhill fever)的病原［2，3］。该菌在国内 C57BL/6J和 KM 小鼠中曾爆发自然感染［4，5］，被列为实验动物清洁级动物必要时检测的项目［6］。分离培养是该菌最常规和经典的检测方法，而因其对营养和气体条件要求较高，培养相对困难［1］，很容易造成漏检。鉴于其危害程度，已有很多念珠状链杆菌检测方法的研究，如间接酶联免疫吸附试验(ELISA)［7］、普通 PCR 方法［8，9］，免疫印迹(IB)［10］、质谱分析法(ESI-MS)［11］和蛋白芯片法［12］等。这些方法多存在特异性、敏感性和操作复杂能问题。近年来已经广泛应用在病原检测的Taqman MGB荧光定量PCR方法［13］以其极高的特异性、灵敏度和检测效率，已经成为临床上的重要检测手段。目前在国内外还未见有应用荧光定量PCR方法检测念珠状链杆菌的报道。本研究应用该技术，建立了一种对念珠状链杆菌的实时荧光定量PCR检测方法，并成功的在动物样本中进行了初步应用。

1 材料

1.1 标准菌株和质粒

1.1.1 标准菌株:念珠状链杆菌(ATCC14647)阳性菌株和23株对照参考菌株:沙门氏菌(CMCC47001)、大肠杆菌(CMCC44711)、肺炎链球菌 (CMCC31210、CMCC36001)、粪链球菌(CMCC32219)、支气管鲍特杆菌(CMCC58401)、多杀巴斯德杆菌(ATCC43137)、嗜肺巴斯德杆菌(ATCC12555)、小鼠放线杆菌(ATCC49577)、肺炎支原体(ATCC15531)、肺支原体(ATCC19612)、鼠棒状杆菌(CMCC65013)、假结核也尔森氏菌(CMCC53501)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(CMCC52301)、绿脓杆菌(ATCC27853)、单核细胞增生性李斯特杆菌(CMCC54004)、宋内氏志贺菌(CMCC51082)、金黄色葡萄球菌(CMCC25923)、啮齿类枸橼酸杆菌(ATCC BAA-352)、阴沟肠杆菌(CMCC13047)、乙型溶血性链球菌(CMCC32210)、白色念珠菌(CMCC10231)、肺炎克雷柏杆菌(CMCC46108)。

1.1.2 标准品质粒:念珠状链杆菌目的片段转化至大肠杆菌感受态细胞JM109由宝生物工程(大连)有限公司合成制备，本室保存。

1.2 培养基和试剂

哥伦比亚血琼脂培养基购自美国 Oxiod，Nuclease-Free Water购自美国Promaga，DNA提取试剂盒QIAamp 96 DNA QIAcube Kit购自德国Qiagen，Taqman Gene Expression Master Mix购自美国ABI。

1.3 动物样本

共823份实验动物呼吸道样本，包括358份小鼠气管、90份大鼠气管、110份豚鼠气管、10份地鼠气管、130份兔咽拭子、65份沙鼠气管收集于北京地区，60份野生驯化树鼩呼吸道样本由中国医学科学院医学生物学研究所提供。

1.4 仪器设备

德国Qiagen QIAcube自动核酸提取仪，美国Thermo Fisher A2生物安全柜，美国ABI 7500Fast荧光定量 PCR仪，上海安亭 WGP-600隔水恒温培养箱。

2 方法

2.1 念珠状链杆菌的培养和DNA的提取

将复苏后冻存的菌种接种于哥伦比亚血琼脂平皿，置37℃培养48 h。菌落使用Qiagen基因组DNA提取试剂盒提取念珠状链杆菌、其他23株参考菌株及动物样品的基因组DNA，操作根据试剂盒说明进行。

2.2 引物和探针

念珠状链杆菌此前被划分为Fusobacteriaceae菌科［14］，而经过近两年的最新研究，目前将念珠状链杆菌与另三个属的菌株 Sebaldella，Sneathia和Leptotrichia重新组成了 Leptotrichiaceae菌科［15］。因此将念珠状链杆菌在内的8株Leptotrichiaceae菌科菌株，以及NCBI Genbank中已知的11株念珠状链杆菌16S rRNA应用Vector NTI advance11进行同源性分析，应用Primer Express 3.0根据16S V3可变区序列设计Taqman MGB荧光定量PCR引物和探针(图1)。上游引物 SmF 24 bp:5’-TTTTCGGATT GTAAAGTGCTTTCA-3’，下游引物 SmR 23 bp:5’-TTTAGCCGTCGCTTCTTCTGTAG-3’，Sm-MGB probe 23 bp:FAM5’-TAGGGAAGAAGAAGATGACGGTA-3’MGBNFQ，目的片段长度72 bp。引物和探针由美国ABI公司合成制备。

2.3 念珠状链杆菌Taqman MGB探针荧光定量PCR(qPCR)检测方法的建立

2.3.1 标准曲线的绘制:将质粒作10倍梯度稀释，浓度为1×109～1拷贝/μL。通过对标准质粒的扩增，优化并确定实时qPCR的反应体系和最佳反应条件。总反应体系20 μL，20×上、下游引物(各 18 μmol/L)和探针(5 μmol/L)混合液 0.5 μL，2 × TaqMan® Gene Expression Master Mix 10 μL，模板 DNA 1 μL，Nuclease-Free Water 8.5 μL。扩增条件:50℃ 2 min，95℃10 min 各 1 个循环;95℃15 s，59℃1 min 40个循环。每个稀释度的标准品同时重复进行3个反应，并用无菌水为模板作为阴性对照。取适宜质粒稀释度的扩增结果绘制标准曲线。

2.3.2 特异性验证:用合成的引物和探针对23株标准菌株进行qPCR反应，观察所建立方法与其他参考菌株有无交叉反应。

2.3.3 敏感性检测:去标准品质粒进行10倍梯度稀释，以浓度为1× 109拷贝/μL、1× 108拷贝 μL、1× 107拷贝/μL、1 ×106拷贝/μL、1 ×105拷贝/μL、1 ×104拷贝/μL、1 ×103拷贝/μL、100 拷贝/μL、10 拷贝/μL 和1 拷贝/μL 各1 μL 作为模板，按上述条件进行qPCR扩增。

2.3.4 重复性检测:以浓度为1×108～1×104拷贝/μL的质粒标准品作为模板，重复进行3次qPCR反应，3次反应的Ct值结果用作组间比对。将标准曲线绘制时的3次重复反应结果用作组内比对。通过计算标准偏差和变异系数分析该方法的重复性。

2.3.5 样品检测:用所建立的方法对小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、沙鼠和树鼩的呼吸道样本进行检测，所得结果与经典的分离培养法进行比较。

3 结果

3.1 标准曲线

取适宜质粒稀释度1×108～1×104拷贝/uL的扩增结果绘制标准曲线。标准曲线方程为Y=-3.34X+43.018，相关系数R2=0.999，扩增效率为99.255%(图2)。

3.2 特异性

该方法对23株标准菌株进行qPCR反应，无交叉反应发生(图3)。念珠状链杆菌阳性对照的初始浓度与1×107拷贝/μL的浓度相当，阴性空白对照无扩增曲线产生。

图1 Leptotrichiaceae菌株16 S rRNA序列分析Fig.1 Analysis of the 16 S rRNA of Leptotrichiaceae strain

图2 念珠状链杆菌Real-time PCR标准曲线Fig.2 Standard curve of the TaqMan MGB probe real time quantitative PCR for S.moniliformis

3.3 敏感性

用倍比稀释的重组质粒作为标准阳性模板进行qPCR(图4)。所建qPCR的最低检测限为10拷贝/μL。

3.4 重复性

对质粒标准品1×109copies/μL～100 copies/μL同时重复3次 qPCR，对1×108copies～1×104copies分3次进行qPCR扩增。所得Ct值计算变异系数(CV)，组内变异系数在0.10～2.31%，组间在0.23～3.67%，均在5%以下，表明重复性了良好，具体结果见表1，表2。

3.5 动物中念珠状链杆菌的检测结果

用所建立的念珠状链杆菌Taqman MGB qPCR检测方法检测小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、长爪沙鼠和野生树鼩共823份动物呼吸道样本进行检测，结果小鼠、大鼠、豚鼠和兔的结果全部为阴性，长爪沙鼠阳性率为1.5%(1/65)，树鼩阳性率为61.7%(37/60)。

4 讨论

16 S rRNA V3高可变区是引物探针设计的理想区域［16］。本研究根据此区域所设计的Taqman引物和MGB探针，能够非常有效的区别包括念珠状链杆菌在内的众多属种的菌株，同时与Fusobacteriaceae菌科其他菌属菌株的比对，保证了所建方法良好的特异性和敏感性。此前荷兰学者Boot所建立的念珠状链杆菌16 S rRNA普通PCR检测方法敏感性可达 2～6 copis/μL，但是对Fusobacterium necrogenes和Sebaldella termitidis也会出现非特异的阳性条带，须利用限制性内切酶BfaI对产物进行酶切才能够区分［8］。

表1 念珠状链杆菌qPCR组内重复性检测Tab.1 Repeatability verification of S.moniliformis real-time quantitative PCR intra-assay in the same sample in different concentrations

表2 念珠装链杆菌qPCR组间重复性检测Tab.2 Repeatability verification of S.moniliformis real-time quantitative PCR inter-assay in different samples in different concentrations

图3 qPCR检测念珠状链杆菌特异性和沙鼠样品检测结果Fig.3 Specificity of the Mongolian gerbil samples and the results of TaqMan MGB probe real time quantitative PCR for S.moniliformis.

图4 qPCR检测念珠状链杆菌敏感性结果Fig.4 Sensitivity results of TaqMan MGB probe real time quantitative PCR for S.moniliformis.

用本研究所建立的Taqman MGB qPCR方法对北京地区绝大部分实验动物中未检出念珠状链杆菌的存在，与培养法的检测结果相符。而在普通级长爪沙鼠和野生树鼩中检测出阳性，与此前的研究结果不同，分离培养法未分离得到念珠状链杆菌［17］。这与 R.Boot的研究结果相符，用 PCR和ELISA方法能够检测出阳性的人工感染大鼠，用培养法则不能检出［8］。念珠状链杆菌对培养条件要求相对较高，通过血琼脂平皿培养时，(48～72)h仅形成(0.5～1)mm的不溶血小菌落，临床样本中又存在大量多种微生物，使分离培养非常困难。长爪沙鼠和树鼩还属于新型实验动物，长爪沙鼠虽已经经过了一定程度的净化，但本研究中所用沙鼠为普通级别，所含微生物种类依然很丰富。树鼩样品为野生驯化种群，其较高的感染率应为其野生状态的直接体现。日本学者Kimura同样根据16 S rRNA建立了普通PCR方法，在褐家鼠(R.norvegicus)和黑鼠(R.rattus)中检出念珠状链杆菌的阳性率分别为92%(61/66)和58%(30/52)，而在SPF及大鼠(Wistar，SD)中则未检测出该菌污染［18］。

念珠状链杆菌作为实验动物微生物质量检测中必要时检测的病原菌，在日常检测中往往会被忽视。本研究发现该菌作为一种重要的人兽共患病原，在实验动物中感染的风险依然较高。经过对标准菌株和823份动物呼吸道样本的验证和检测，所建立的荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性，能够满足快速检测念珠状链杆菌的要求。

［1］Wullenweber M.Streptobacillus moniliformis— a zoonotic pathogen.Taxonomic considerations，host species，diagnosis，therapy，geographical distribution［J］.Lab Anim，1995.29(1):1-15.

［2］Elliott SP.Rat bite fever and Streptobacillus moniliformis［J］.Clinl Microbiol Rev.2007，20(1):13-22.

［3］刘星，李红.念珠状链杆菌的研究现状［J］.中国实验动物学报，2007(06):474-476.

［4］李红，陈卫兰，蒋观成，等.念珠状链杆菌在小鼠群中的自然感染和发病特征的观察［J］.中国实验动物学报，1995，3(02):80-86.

［5］王春玲，关伟红，蔡锦霞，等.实验小鼠念珠状链杆菌和鼠痘病毒混合感染的诊断［J］.实验动物科学与管理，1999，16(1):3-5.

［6］GB/T 14922.2-2010，实验动物 微生物学等级及监测［S］，中华人民共和国国家标准，2010.

［7］Boot R，Bakker RH，Thuis H，et al.An enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)for monitoring rodent colonies for Streptobacillus moniliformis antibodies［J］.Lab Anim，1993.27(4):350-357.

［8］Boot R，Oosterhuis A，Thuis HC，et al.PCR for the detection of Streptobacillus moniliformis［J］.Lab Anim，2002.36(2):200-208.

［9］Boot R，Van de Berg L，Reubsaet FA，et al.Positive Streptobacillus moniliformis PCR in guinea pigs likely due to Leptotrichia spp［J］.Vet Microbiol.2008，128(3-4):395-399.

［10］Boot R，Van de Berg L，Vlemminx MJ，et al.Detection of antibodies to Streptobacillus moniliformis in rats by an immunoblot procedure［J］.Lab Anim，2006.40(4):447-455.

［11］Mackey JR，Melendez EL，Farrell JJ，et al.Direct detection of indirect transmission of Streptobacillus moniliformis rat bite fever infection［J］.J Clin Microbiol，2014，52(6):2259-2261.

［12］林树柱，张丽芳，刘星，等.实验动物病原菌的一体化蛋白芯片检测方法［D］，实验动物与药理学、毒理学研究学术交流会论文汇编，2009，253-257.

［13］Afonina IA，Reed MW，Lusby E，et al.Minor groove binderconjugated DNA probes for quantitative DNA detection by hybridization-triggered fluorescence［J］.Biotechniques.2002，32(4):940-4，946-9.

［14］Gaastra W，Boot R，Ho HT，et al.Rat bite fever［J］.Vet Microbiol，2009.133(3):211-228.

［15］Staley JT，Whitman WB，Krieg NR，et al.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology，Vol.4(2nd ed.)［M］.New York，Springer.2011，789.

［16］Chakravorty S，Helb D，Burday M，et al.A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria［J］.J Microbiol Methods，2007.69(2):330-339.

［17］邢进，冯育芳，付瑞，等.野生树鼩可培养细菌和真菌携带情况的调查［J］.实验动物科学，2012，29(03):34-38.

［18］Kimura M， Tanikawa T， Suzuki M， et al.Detection of Streptobacillus spp.in feral rats by specific polymerase chain reaction［J］.Microbiol Immunol.2008，52(1):9-15.