螺旋藻体外清除自由基的ESR研究

赵淑锐，郑美青，吴英婷，薛　冰（首都医科大学医学实验与测试中心，北京100069）

螺旋藻体外清除自由基的ESR研究

赵淑锐，郑美青，吴英婷，薛冰
（首都医科大学医学实验与测试中心，北京100069）

摘要：利用DPPH、Fenton反应、SNAP、黄嘌呤氧化酶氧化黄嘌呤反应产生活性有机氮自由基、羟自由基（·OH）、一氧化氮（NO）自由基、超氧阴离子（·O2-）自由基，以电子顺磁共振法（ESR）研究了螺旋藻体外清除上述四种自由基的作用。该方法操作简单易行，结果直观。结果表明螺旋藻能有效清除上述4种自由基，而且随浓度的增加抗氧化能力也增加，浓度在40 mg/mL时对超氧阴离子和有机氮自由基的清除率达到了90%以上。

关键词：螺旋藻；DPPH；羟自由基；一氧化氮自由基；超氧阴离子；电子顺磁共振

tron paramagnetic resonance

自由基是一种含不成对电子的分子、原子或离子，是生物体在新陈代谢过程中产生的中间代谢产物[1]。常见的自由基有：超氧阴离子自由基、羟自由基、脂质自由基、一氧化氮自由基、有机自由基等。自由基很不稳定，极容易与其它物质反应生成新的自由基，因而产生连锁反应[2]。自由基通过各种不同的途径，干扰重要的生理过程[3]，与心脏疾病、脑血管疾病、糖尿病、肿瘤、高血压、衰老、皮肤皱纹、老年痴呆、老年性白内障、静脉曲张等70多种疾病有关[4]。因此，研究抑制自由基反应的抗氧化剂有重大意义。

电子顺磁共振（ESR）是直接检测和研究含有未成对电子的顺磁性物质的一种现代分析方法[5]。ESR技术是利用具有单电子的物质在静磁场作用下吸收电磁波能量而完成电子能级间跃迁的这种特性，对顺磁性的物质进行检测和分析，它也是检测单电子的唯一直接的方法，ESR检测技术具有灵敏度高、无干扰、样品不受破坏等优点，是目前检测自由基最直接、最有效的方法之一[6]。

近几年有大量研究表明，螺旋藻具有降血脂、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、抗凝血、抗氧化及增强机体免疫力等生物活性[7]。本实验利用电磁共振技术，选取常见的不同种自由基，初步研究了钝顶螺旋藻对不同自由基的清除能力。

1　材料与方法

1.1材料

钝顶螺旋藻粉：云南天然坊生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）、5，5-二甲基-1-氧化吡咯啉（DMPO）、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）、黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、二乙基三胺五乙酸（DETAPAC）均购自美国Sigma公司；N-甲基-葡萄糖胺（MGD）；二氧六环、30%过氧化氢：分析纯，北京化工厂；七水合硫酸亚铁：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；超纯水：美国Millipore公司Milli-Q Academic A10超纯水系统生产。

1.2仪器设备

JES-FA300电子自旋共振仪及配套设备：石英标准样品管（内径为4 mm）。

1.3方法

1.3.1样品预处理

准确称取40 mg钝顶螺旋藻粉，加1 mL蒸馏水，充分振荡，得到浓度为40 mg/mL的悬浊液，然后用蒸馏水稀释至20、10、5、1、0.5 mg/mL。

1.3.2试剂的配置

称取8 mg DPPH，溶解于10 mL二氧六环中，浓度为2×10-3mol/L。称取七水合硫酸亚铁27.8 mg，溶解于10 mL蒸馏水中，浓度为10 mmol/L。称取MGD7.3 mg，溶解于1 mL蒸馏水中，浓度为25 mmol/L。称取SNAP 2.2 mg，溶解于10 mL蒸馏水中，浓度为1 mmol/L。将30%的H2O2用蒸馏水稀释至浓度为1%的H2O2。称取黄嘌呤300 mg，溶于3.5 mL蒸馏水中，浓度为560 mmol/L。吸取黄嘌呤氧化酶100 μL，用蒸馏水稀释至1 mL。称取DETAPAC 1 mg，溶解于3 mL蒸馏水中，浓度为0.9 mmol/L。称取DMPO 22.6 mg，溶于2 mL蒸馏水中，浓度为100 mmol/L，加入200 mg活性炭，搅拌10 min，过滤，备用。以上试剂均需现用现配。

1.3.3Fenton反应产生·OH及清除活性测定

本实验利用Fe2+经H2O2氧化成Fe3+产生的羟自由基，由自旋捕捉剂DMPO捕捉，经电子顺磁共振仪扫描，得到羟自由基的特征谱图。10 mmol/L的七水合硫酸亚铁溶液，蒸馏水，100 mmol/L的DMPO水溶液，1%的H2O2溶液。以上4种试剂按顺序各取5 μL注入EP管，混匀后快速装入石英毛细管中，然后外加样品保护测试管，一并放入ESR波谱仪的谐振腔中进行测定，作为对照样品，以扣除试剂本身对自由基的影响。测样品时用样品溶液代替蒸馏水，其余操作同上。每个浓度做3个平行样，测量后取平均值，结果见图1。

自由基清除率（%）的计算公式：I=（h0-hx）/h0×100，式中：h0为对照样品中ESR谱信号强度测量值；hx为样品中ESR谱信号强度测量值。由图1可见，I值越大，清除自由基能力越强。样品测试条件为：扫描时间1min、中心磁场336 mT、扫描宽度15 mT、微波功率1 mW、调制宽度0.35 mT。

1.3.4清除NO自由基的测定

本实验利用SNAP作为NO自由基供体，用铁盐络合物MGD-Fe捕捉NO自由基。经电子顺磁共振仪扫描，得到一氧化氮自由基的特征谱图。10 mmol/L的七水合硫酸亚铁溶液，25 mmol/L的MGD水溶液，蒸馏水，1 mmol/L的SNAP水溶液。以上4种试剂按顺序各取5 μL注入EP管，混匀后快速装入石英毛细管中，然后外加样品保护测试管，一并放入ESR波谱仪的谐振腔中进行测定，作为对照样品，以扣除试剂本身对自由基的影响。测样品时用样品溶液代替蒸馏水，其余操作同上。每个浓度做3个平行样，测量后取平均值，结果见图2。

图1　羟自由基（·OH）图谱Fig.1　Spectrum of hydroxyl radical（·OH）

图2　一氧化氮（NO）自由基图谱Fig.2　Spectrum of nitric oxide radical（NO）

自由基清除率（%）的计算公式：I=（h0-hx）/h0×100，式中：h0为对照样品中ESR谱信号强度测量值；hx为样品中ESR谱信号强度测量值。由图2可见，I值越大，清除自由基能力越强（见图2）。样品测试条件为：扫描时间1 min、中心磁场330 mT、扫描宽度15 mT、微波功率1 mW、调制宽度0.35 mT。

1.3.5清除超氧阴离子自由基的测定

本试验利用黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶反应生成超氧阴离子，用DMPO捕捉超氧阴离子。经电子顺磁共振仪扫描，得到超氧阴离子的特征谱图。100 mmol/L 的DMPO溶液，0.9 mmol/L的DETAPAC水溶液，560 mmol/L的黄嘌呤水溶液，蒸馏水，稀释10倍后的黄嘌呤氧化酶水溶液。以上4种试剂按顺序各取5 μL注入EP管，混匀后快速装入石英毛细管中，然后外加样品保护测试管，一并放入ESR波谱仪的谐振腔中进行测定，作为对照样品，以扣除试剂本身对自由基的影响。测样品时用样品溶液代替蒸馏水，其余操作同上。每个浓度做3个平行样，测量后取平均值，结果见图3。

图3　超氧阴离子自由基（·O2-）图谱Fig.3　Spectrum of Superoxide anion（·O2-）

自由基清除率（%）的计算公式：I=（h0-hx）/h0×100，式中：h0为对照样品中ESR谱信号强度测量值；hx为样品中ESR谱信号强度测量值。由图3可见，I值越大，清除自由基能力越强。样品测试条件为：扫描时间1 min、中心磁场336 mT、扫描宽度15 mT、微波功率5 mW、调制宽度0.05 mT。

1.3.6清除DPPH有机自由基的测试方法

2×10-3mol/L的DPPH溶液，蒸馏水，以上2种试剂各取10 μL注入EP管，混匀后快速装入石英毛细管中，然后外加样品保护测试管，一并放入ESR波谱仪的谐振腔中进行测定，作为对照样品，以扣除试剂本身对自由基的影响。测样品时用样品液代替蒸馏水，其余操作同上。每个浓度做3个平行样，测量后取平均值，结果见图4。

图4　DPPH有机氮自由基图谱Fig.4　Spectrum of organic nitrogen radicals（DPPH）

自由基清除率（%）的计算公式：I=（h0-hx）/h0×100，式中：h0为对照体系中ESR谱信号强度测量值；hx为样品体系中ESR谱信号强度测量值。由图4可见，I值越大，清除自由基能力越强（见图4）。

样品测试条件为：扫描时间1 min；中心磁场中心磁场336 mT、扫描宽度15 mT、微波功率1 mW、调制宽度0.35 mT。

2　结果与讨论

2.1螺旋藻对不同自由基的清除作用

2.1.1螺旋藻对羟自由基的清除效果

螺旋藻对羟自由基的清除效果见图5。

图5　不同浓度的测试样品对羟自由基（·OH）的清除效果图Fig.5　Scavenging effect of different concentrations of test samples on hydroxyl radical（·OH）

2.1.2螺旋藻对一氧化氮自由基的清除效果

螺旋藻对一氧化氮自由基的清除效果见图6。

2.1.3螺旋藻对超氧阴离子自由基的清除效果

螺旋藻对超氧阴离子自由基的清除效果见图7。

图7　不同浓度的测试样品对超氧阴离子（·O2-）自由基的清除效果图Fig.7　Scavenging effect of different concentrations of test samples on Superoxide anion（·O2-）

2.1.4螺旋藻对DPPH有机自由基的清除效果

螺旋藻对DPPH有机自由基的清除效果见图8。

图8　不同浓度的测试样品对DPPH有机氮自由基的清除效果图Fig.8　Scavenging effect of different concentrations of test samples on organic nitrogen radicals（DPPH）

2.2螺旋藻对不同自由基清除作用的分析

由图1、图2、图3、图4可以看出，螺旋藻对不同种自由基均表现了较好的清除能力。将螺旋藻对不同自由基的清除率作图分析，见图9。

图9　螺旋藻在不同浓度下对不同自由基的清除率Fig.9　The radical scavenging rate of spiraling in different concentrations

由图5～图9可以看出钝顶螺旋藻不仅对不同自由基有较好的清除作用，而且随着浓度的增加，清除的效率也在提高。螺旋藻在40 mg/mL时对超氧阴离子自由基的清除作用达到了90%，对DPPH有机自由的清除作用达到了97%。

3　结论

随着年龄增长，机体内自由基水平呈增长趋势，但由于机体老化，自由基清除机制却逐步退化，结果造成体内自由基大量积聚[7]。由此自由基对机体的健康危害日益加重，引发了多种生理功能的障碍，促进多种老年疾病的发生发展，导致机体的衰亡。近年来有大量资料表明这些细胞的衰老、死亡，许多属于自由基引发的细胞凋亡[8]。

针对几种常见的自由基，运用ESR法直接测试螺旋藻的抗氧化能力[9]，也较好地反映螺旋藻对不同自由基的清除能力。进一步说明了钝顶螺旋藻粉具有降血脂、抗肿瘤[10]、抗病毒、抗辐射、抗凝血、抗氧化及增强机体免疫力等生物活性[11]。

运用ESR（顺磁共振）法可以直接对钝顶螺旋藻粉进行测试，而不需要对其进行烘干、研磨、提取等繁琐步骤，不会破坏其自身的成分，更能直观地表现其抗氧化能力。相比其他的紫外分光光度计方法，酶联免疫法具有较大优势，减少了处理步骤，避免了钝顶螺旋藻粉里活性物质的丢失，更能真实地反映其的抗氧化能力。另外该方法快速灵敏，可用于其它食品的研究。另外，国际上已经将抗氧化检测用于抗衰老保健食品的评价[12]，对保健食品的开发具有重要的作用与意义。此次研究对于开发以螺旋藻为原料的保健食品或新药具有一定指导意义。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.023

收稿日期：2014-07-16

作者简介：赵淑锐（1983—），女（汉），主管技师，硕士，研究方向：大型仪器分析在食品和药品中的应用。

Investigation with ESR on the Radical Scavenging Effect of Spirulina in Vitro

ZHAO Shu-rui，ZHENG Mei-qing，WU Ying-ting，XUE Bing
（Medical Experiment and Test Center，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Abstract：Organic nitrogen radicals，hydroxyl radicals（·OH），nitric oxide（NO）radicals，superoxide anion radicals（·O2-）were produced by DPPH，Fenton reaction，SNAP，oxidation reaction of xanthine and xanthine oxidase.The antioxidant activities of spirulina in different concentrations were determined by the four radicals scavenging activity using electron paramagnetic resonance（ESR）Technology.The method was simple and easy to observe the results.Experimental results showed that spirulina have strong free radical scavenging capacity.The free radicalscavenging capacitywasincreasedby increasing concentrations.when the concentration in 40 mg/mL，

the scavenging rates of Superoxide anion and organic nitrogen radicals reached more than 90%.

Key words：spirulina；DPPH；hydroxyl（OH）radicals；nitric oxide（NO）radicals；superoxide anion；elec