香蕉多糖的抗菌活性研究

沈建林，沈红元（湖北职业技术学院，湖北孝感432000）

香蕉多糖的抗菌活性研究

沈建林，沈红元*
（湖北职业技术学院，湖北孝感432000）

摘要：采用15%乙醇溶液作为溶剂提取香蕉多糖，并采用纸片琼脂扩散法研究了香蕉多糖的抗菌活性。实验发现香蕉多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抗菌活性测试均具有抗菌作用，其中对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的最小抗菌浓度（MIC）分别为15、25、20 mg/mL。

关键词：香蕉；多糖；提取；抗菌

多糖具有多方面的复杂生物活性与功能，多糖的糖链能控制细胞的分裂与分化，调节细胞的生长与衰老。在抗肿瘤、抗病毒以及抗白血病等的防治上具有独特的功效。多糖在抗凝血、降血糖、降血脂方面的作用研究比较多，这为治疗和预防心脑血管疾病提供了一个热点领域。此外，多糖抗氧化活性、对双歧杆菌增殖、抗溃疡、抗菌[1-2]等作用研究也屡见报道。

日本帝国大学药学部研究发现香蕉果汁有增强免疫功能、抑制癌细胞增殖、缩小癌症病灶、预防大肠菌及葡萄球菌感染等效果，这一新发现引起了医学界、食品业界的高度关注。香蕉中含糖量近20%，但目前国内外对香蕉多糖生物活性研究的相关报道较少。而越来越多的多糖活性研究显示，香蕉的某些营养功能和药理作用很可能与其高含量的多糖成分有关。本文对香蕉多糖的抗菌活性进行了初步研究，为探讨香蕉多糖在医学上的深入研究和应用开发提供科学依据。

1　香蕉多糖的提取及纯化

1.1材料及检测方法

1.1.1材料

香蕉：市售普通香蕉。

1.1.2试剂

丙酮（分析纯）：沙市化学试剂厂；无水乙醇（分析纯）：上海振兴化工厂；蒽酮（分析纯）：上海五联化工厂；葡萄糖（分析纯）：汕头西陇化工厂；活性炭（分析纯）；纤维素酶（分析纯）：上海伯奥生物科技有限公司提供，酶活≥15 U/mg；果胶酶（分析纯）：SERVA公司提供，酶活≥0.35 U/mg；正丁醇、氯仿均为分析纯；青霉素、链霉素：购于湖北省肿瘤医院。

供试菌种：埃希大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌。

1.1.3仪器

RE-52A旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；GL20A全自动高速冷冻离心机：湘西仪器仪表总厂机械仪器厂；DZF-6021型真空干燥箱：上海益恒实验仪器有限公司；UV-2100紫外可见分光光度计：尤尼卡仪器有限公司；8000目透析袋；ALPHA 1-4冷冻干燥机（CHRIST）；40公分立式高压蒸气消毒器：武汉国光医疗器械厂；血球计数板；显微镜。

总糖测定方法：蒽酮-硫酸法[3]。

1.2香蕉多糖的提取及纯化

从植物中提取多糖成分多用水或稀碱，由于香蕉中含有多酚氧化酶，使香蕉氧化，故先对香蕉进行热烫灭酶预处理，再加纤维素酶、果胶酶酶解，以破坏香蕉细胞壁，最后用溶剂浸提，乙醇沉淀提取香蕉多糖。然后，通过一系列步骤除去了香蕉多糖中的杂质，包括除蛋白质，无机盐和小分子糖等。

1.2.1热烫

选用皮黄带少量褐斑的九成熟普通香蕉，清洗干净，剥皮后切段，按文献[4]的方法高温蒸气灭酶（105℃，5 min）后迅速降温，然后用食品打浆机打成香蕉浆。

1.2.2冻融

香蕉浆用低温冷冻20 min后，迅速移至40℃水浴处理15 min，反复处理3次，以破坏其细胞壁。

1.2.3酶解

取冻融后的香蕉浆加0.5%果胶酶和0.2%纤维素酶，在45℃水浴中酶解2 h。

1.2.4浸提

用15%乙醇溶液，在90℃水浴中浸提2 h，提取2次，合并提取液。将提取液进行离心（5 000 r/min，10 min）分离，去渣，取上清液浓缩。

1.2.5醇沉

采用低压浓缩法对样品进行浓缩，浓缩比约为5∶1。浓缩液用4倍体积95%（体积分数）乙醇溶液沉淀，静置2 h～4 h后离心（5 000 r/min，10 min）分离，沉淀再用少量水溶解，用95%乙醇再沉淀1次，离心取沉淀。

1.2.6除蛋白质

本试验采用Sevag法除蛋白质。先将香蕉粗多糖用适量双蒸水溶解，将Sevag试剂[氯仿∶正丁醇（体积比）=4∶1混合]加至样品中，搅拌，蛋白质在水和Sevag试剂间形成凝胶，离心分液除去，反复操作5次～8次。

1.2.7脱色

将样品通过活性炭柱进行脱色。

1.2.8透析

用8 000目透析袋进行透析。

1.2.9脱水

再经过浓缩、醇沉，再将沉淀先后用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤2次。

1.2.10真空干燥

将脱水后的样品低温真空干燥，至恒重，即得香蕉多糖。真空干燥等得到香蕉多糖，蒽酮-硫酸法测得其总糖含量为90.56%。

2　香蕉多糖的抗菌活性研究

细菌对抗菌活性物质的敏感试验，是指在体外测定活性物质抑菌或杀死细菌的能力。抗菌活性实验的测定方法颇多，目前常用的都是基于扩散法和稀释法两种。本文采用纸片琼脂扩散法[5]对香蕉多糖的抗菌活性进行了初步研究，包括香蕉多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抗菌活性测试。

2.1抗菌圈试验

2.1.1材料

供试培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（直径90mm平皿，琼脂厚4mm）。按培养基配方比例依次准确称取各组分放入烧杯中。在烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，加热使其溶解。等药品完全溶解后，补充水分至所需总体积。将琼脂放入已溶化的药品中，在加热过程中不断搅拌，最后，补足所失的水分。调节pH至7.1。1.05kg/cm2、121.3℃，灭菌20min，4℃保存备用。配方如下：牛肉胨5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL、pH7.1。

增菌培养及菌液的配制将菌种划线于牛肉胨膏蛋白胨平板上，35℃培养24h，分出其单个菌落，将单个菌落接种到牛肉膏蛋白胨肉汤中，35℃培养24 h，然后用血球计数板确定菌的浓度，MH肉汤稀释后使其最终菌量（集落形成单位，CFU）为1.5×108CFU。

含受试物及阳性对照药物的干燥纸片 选用新华1号定性滤纸，用打孔机制作直径6.20 mm的小圆片，置于平皿内高压灭菌（103.4 kPa，20 min），取出后置于烘箱内烘干，分装于灭菌小瓶内。以无菌蒸馏水将香蕉多糖配成40、60、80 mg/mL、青霉素和链霉素稀释成50 mg/mL。取稀释液1 mL加入装有纸片的小瓶中，浸泡1.5 h，然后真空干燥，保存于冰箱中。

2.1.2原理与方法

将含有—定量的抗菌药物纸片，平贴在已经接种被测细菌的琼脂培养基上，纸片中的抗菌药物溶解于培养基内，并向四周呈球面扩散，抗菌活性物质在琼脂中的浓度随离开纸片的距离增大而降低。同时，含菌琼脂经孵育后细菌开始生长。在琼脂内的药物浓度恰高于该物质对待检菌的最低抗菌浓度时，该细菌的生长就受到抑制，在纸片的周围形成透明的抗菌环。观察抗菌环的有无及其大小，就可以判断其敏感性。

用棉拭了蘸取菌液（菌液浓度为1.5×108CFU/mL）涂布整个培养基表面，反复几次，保证涂布均匀。

用镊子分别夹取含有香蕉多糖、青霉素和链霉素的滤纸片，贴在巳接种细菌的琼脂平板的表面。每个平板各纸片中心相距约24 mm，纸片距平皿边缘约15 mm，各纸片间距离相等。

37℃培养24 h后，观察抗菌圈的有无及其大小。测量香蕉多糖纸片抗菌环的直径（以mm表示），并与阴性、阳性对照比较，判断其敏感性。

2.1.3试验结果

香蕉多糖对供试菌种的抗菌圈见表1。

表1　香蕉多糖对供试菌种的抗菌圈Table 1　The antibacterial range of banana polysaccharide to bacteria substitute

2.2最小抗菌浓度（MIC）测定试验

2.2.1原理与方法

将各供试菌种进行活化后，分别用接种环挑取适量细菌，用无菌生理盐水稀释，振荡2 min，调整菌液浓度为约100个/mL，取各种菌悬液0.1 mL，分别加入到含有各种浓度（35、30、25、20、15、10、5 mg/mL）的香蕉多糖的液体培养基中，充分摇匀，37℃培养24 h。取出观察，如果管底有膜状生成物或试管内液体浑浊则为阳性管；管内液体澄清，肉眼未见有菌生长者为阴性管。找出最小抗菌浓度的阴性管，即为其最小抗菌浓度（MIC）。

2.2.2试验结果

香蕉多糖对供试菌种的最小抗菌浓度见表2。

试验数据显示，香蕉多糖对大肠杆菌的最小抗菌浓度为15 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抗菌浓度为25mg/mL，对绿脓杆菌的最小抗菌浓度为20mg/mL。

表2　香蕉多糖对供试菌种的最小抗菌浓度Table 2　The minimum antibacterial concentration of bananapolysaccharide to bacteria substitute

3　讨论

从香蕉多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的抗菌活性测试结果的抗菌环直径与阴性、阳性对照比较来看，香蕉多糖对3种细菌具有一定的抗菌活性，但其抗菌活性较弱。这有可能与受试香蕉多糖没有水解有关，因为多糖水解程度高低与潜在的抗菌活性基团的暴露可能有着非常密切的关系[6]。这提示，要对香蕉多糖的抗菌活性进行进一步的确定必须从其不同程度的水解产物入手。当然，从香蕉多糖的抗菌活性大小来看，其活性还是较弱的，可能是香蕉多糖的分子结构中的抗菌活性基团很少或者活性并非很强；或者是香蕉多糖对某些菌种具有特异性的抗菌活性，而非广谱抗菌，这些有待于进一步的试验证实。今后还应更深入从其结构入手，系统地研究其结构与活性的关系。

参考文献：

[1]刘春兰,杨逸,何林,等.植物多糖抑菌作用研究方法进展[J].时珍国医国药,2013,24(7):1725-1727

[2]张海艳,郑玲.马齿苋多糖的提取及体外抗菌活[J]性.江苏农业科学,2011,39(5):413-415

[3]李如亮.生物化学实验[M].武汉:武汉大学出版社,1998

[4]李光磊,惠明.王清德,等.香蕉中多酚氧化酶特性探讨[J].粮油加工与食品机械,2001(6):27-28

[5]张卓然.医学微生物实验学[M].2版.北京:科学出版社,1998:52-55

[6]郭凌,包惠燕,叶绍明,等.琼枝麒麟菜和异枝麒麟菜硫酸多糖及其水解产物的抑菌作用[J].暨南大学学报(自然科学版),2002,23 (3):79-83

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.017

收稿日期：2014-05-08

作者简介：沈建林（1970—），男（汉），副教授，硕士研究生，主要从事功能性食品开发与研究。

*通信作者

Studies on Antibacterial Activity of Banana Polysaccharide

SHEN Jian-lin，SHEN Hong-yuan*
（Hubei Polytechnic Institute，Xiaogan 432000，Hubei，China）

Abstract：By extracting the banana polysaccharide after using the 15%ethanol solution as the solvent，the authors studied its antibacterial activity by Disc agar diffusion method.From experiments，the authors discover that the banana polysaccharide had antibacterial effects on escherichia coli，staphylococcus aureus and pseudomonas by antibacterial activity tests，while the minimum antibacterial concentration（MIC）of escherichia coli，staphylococcus aureus and pseudomonas was 15，25，20 mg/mL respectively.

Key words：banana；polysaccharide；extracting；antibacterial