HPLC法测定白刺籽中槲皮素和山萘酚的含量

宋永朋，马华丽（青海省轻工业研究所有限责任公司，青海西宁810001）

HPLC法测定白刺籽中槲皮素和山萘酚的含量

宋永朋，马华丽
（青海省轻工业研究所有限责任公司，青海西宁810001）

摘要：采用高效液相色谱法测定白刺籽中槲皮素和山萘酚的含量。采用的条件为Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相甲醇-水（含0.4%的磷酸）48∶52的比例线性洗脱，流速1 mL/min；检测波长360 nm；柱温35℃。两种成分均达到基线分离，槲皮素的线性范围为0.029 28 μg～0.204 96 μg，山萘酚的线性范围为0.003 4 μg～0.011 9 μg；槲皮素的平均回收率为100.7%（RSD=2.1%），山萘酚的平均回收率为98.5%（RSD=1.7%）。

关键词：高效液相色谱；槲皮素；山萘酚；白刺籽

白刺为蒺藜科白刺属甘青白刺（Nitraria tangutorum Bor）的果实，俗称酸胖、地枣、沙樱桃等。白刺作为沙漠中罕见的野生浆果，即可鲜食，又可入药。具有健脾胃，助消化，安神，解表，下乳等功效，可治疗脾胃虚弱、消化不良、神经衰弱、月经不调等症[1]。采用树脂及正反相硅胶色谱柱从白刺籽中分离纯化出6种化合物，经波谱分析鉴定为胡萝卜苷、4-羟基六氢吡啶羧酸、槲皮素、尿囊素、1-甲基-1，2，3，4四氢-B-咔啉-3-羧基酸，L-酪氨酸[2]。但用高效液相色谱法测定上述化学成分含量的方法鲜见报道，由于对照品的局限性，本文现只对于白刺籽中槲皮素和山萘酚进行了方法学研究。

1　仪器、试剂及样品采集

1.1仪器

Agilent1100高效液相色谱仪、KQ3200B超声波清洗器：昆仑超声仪器有限公司；FZ102植物试样粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；ME2353电子天平：北京赛多利斯仪器有限公司。

1.2试剂及材料

甲醇（色谱纯）：山东禹王实业有限公司禹城化工厂；二次蒸馏水、磷酸（分析纯）：北京红星化工厂；槲皮素（批号100081-200406）和山萘酚（批号110861-200405）对照品：中国药品生物制品检定所。白刺籽是白刺果经压榨后得到的种子。白刺籽晾干后粉碎过80目筛，保存备用。

2　方法与结果

2.1溶液配制

2.1.1对照品储备液

准确称取对照品槲皮素0.366mg、山萘酚0.034mg、分别置10 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，配制成相应浓度的对照品储备液，使用时稀释为所需浓度。

2.1.2样品溶液

准确称取粉碎至80目的白刺籽样品2.000 4 g，加入甲醇15 mL，超声提取45 min，抽滤，以甲醇洗涤滤渣2次，每次1 mL。滤渣重复上述操作3次，所得滤液与前一次滤液合并，浓缩后定容至50 mL。过0.45 μm滤膜，在选定色谱条件下测定有效成分的含量。

2.2色谱条件

色谱柱：Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流动相：甲醇和水（含0.04%磷酸）=48∶52；流速1 mL/min；检测波长为360 nm，柱温35℃。该色谱条件下槲皮素和山萘酚2种成分均被洗脱且达到基线分离，保留时间分别为12.001、20.179 min，见图1。

图1　对照品及样品色谱图Fig.1　Chromatograms of chemical reference subetancea and sample

2.3线性关系考察

精密量取2种对照品储备液，以甲醇溶解，配成浓度分别为槲皮素0.029 28、0.058 56、0.087 84、0.117 12、0.1464、0.20496mg/mL；山萘酚0.0034、0.0051、0.0068、0.008 5、0.010 2、0.011 9 mg/mL的对照品标液系列溶液，每次进样5 μL，以峰面积的积分值定量。槲皮素、山萘酚的回归方程分别如下：A=3 852.6C-7 362，r2= 0.999 2；A=18 961C+2.150 5，r2=0.998 8；（见图2、图3）线性范围分别为0.029 28 μg～0.204 96 μg，0.003 4 μg～0.011 9 μg。

图2　槲皮素标准曲线Fig.2　Standard curve of quercetin

图3　山萘酚标准曲线Fig.3　Standard curve of kaemferol

2.4检测限

在选定的色谱条件下，当信噪比S/N=3时，对各组分最低检测限进行测定，结果槲皮素、山萘酚的最低检测限分别为0.25、0.38 ng。

2.5精密度试验

取浓度为 0.073 2 mg/mL槲皮素，山萘酚0.004 25 mg/mL对照品溶液，在选定的色谱条件下测定色谱峰的峰面积，经计算RSD分别为0.64%、0.49% （n=5），表明仪器精密度良好。

2.6重复性试验

准确称取白刺籽样品2.0 g，共6份，按“2.1.2”方法操作，在选定的色谱条件下测定槲皮素、山萘酚的含量，经计算RSD分别为1.4%、2.3%（n=5），表明该方法重复性良好。

2.7回收试验精密

准确称取3份已测知含量的白刺籽样品各0.5g，添加各对照品溶液适量，按“2.1.2”方法操作，测得槲皮素、山萘酚平均回收率（n=5）分别为100.7%、98.7%，RSD分别为2.1%、1.7%。回收率试验结果见表2。

表2　回收率试验结果（n=5）Table 2　Recoveries of added sample（n=5）

3　结论与讨论

3.1结论

取2.1.2制备的样品溶液按上述色谱条件进行分析，经DAD检测器检测上述2种待测组分的峰纯度且其紫外光谱与对照品一致后，按外标法以峰面积积分值计算，得3种有效成分的含量（每个样品重复进样3次，取平均值置信区间95%）结果白刺籽中槲皮素的含量为1.987 2 μg/μL、山萘酚的含量为0.019 6 μg/μL。

3.2讨论

3.2.1检测波长的确定

上述对照品溶液分别进样后，利用DAD检测器在200 nm～400 nm扫描其吸收光谱，槲皮素和山萘酚对照品均在360 nm波长处有较高的吸收[3-4]，故选择该波长为检测波长。

3.2.2流动相的选择

上述2种有效成分色谱峰易拖尾，经试验，当在水中加入0.004%（体积比）磷酸时可改善槲皮素和山萘酚的峰形，故选择甲醇和含0.004%磷酸的水做流动相。

总之，用HPLC法测定白刺籽中2种成份的含量，具有分析简便快速、结果准确可靠的特点，对全面评价药物质量有积极的作用。

参考文献：

[1]中国科学院冰川冻土沙漠研究所.中国沙漠地区药用植物[M].兰州:甘肃人民出版社,1973:538

[2]王洪伦,李玉林,王小燕,等.柴达木盆地唐古特白刺种子的化学成分研究[J].天然产物研究与开发,2007,19(4):614-616

[3]卢永昌,闫红.HPLC测定雪莲中芦丁和槲皮素的含量[J].华西药学杂志,2007,22(1):79-80

[4]赵文彬,刘金荣,樊莲莲,等.从槐米中提取槲皮素方法的研究[J].石河子大学学报(自然科学版),2006,24(3):301-304

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.035

收稿日期：2014-04-02

基金项目：科技部科技型中小企业技术创新基金（12C26216307131）

作者简介：宋永朋（1986—），男（汉），助理研究员，研究生，现从事青藏高原特色生物资源开发工作。

Determination of Quercetin and Kaemferol in the Seed of Nitraria Tangutorum Bobr by HPLC

SONG Yong-peng，MA Hua-li
（Qinghai Light Industry Institute Co.，Ltd，Xining 810001，Qinghai，China）

Abstract：To determination the content of quercetin and rantiliroside of Nitraria tangutorum Bobr by HPLC.The samples were separated with the column of Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）which was eluted with methanol and water（0.04%phosphoric acid）in 48∶52 with detected wavelength at 360 nm，flow rate at 1 mL/ min，column temperature at 35℃.The results indicated that two compounds were basically insolated.The linear ranges of quercetin and kaemferol were 0.029 28 μg-0.204 96 μg，0.003 4 μg-0.011 9 μg respectively；the average recoveries were 100.7%（RSD=2.1%），98.5%（RSD=1.7%）respectively.

Key words：HPLC；quercetin；kaemferol；Nitraria tangutorum Bobr