大鼠肉瘤蛋白样激活剂2在结肠癌中的表达及临床意义

廖真，宁辉，刘伟，芦伟

（湖北省恩施州来凤县中心医院普外胸外科，湖北恩施445700）

·论著·

大鼠肉瘤蛋白样激活剂2在结肠癌中的表达及临床意义

廖真，宁辉，刘伟，芦伟

（湖北省恩施州来凤县中心医院普外胸外科，湖北恩施445700）

目的检测大鼠肉瘤蛋白样激活剂2（RASAL2）在结肠癌组织中的表达，探讨其与结肠癌临床病理特征的相关性及意义。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）、蛋白质印迹及免疫组织化学法检测RASAL2在42例结肠癌及其癌旁组织中的表达，分析其与结肠癌临床病理特征的相关性。结果qRT-PCR及蛋白质印迹检测显示，RASAL2在结肠癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织（P＜0.05）；免疫组织化学法染色结果显示，RASAL2在结肠癌组织中的高表达率明显低于癌旁组织（42.9％vs 88.1％，χ2=19.012，P＜0.01），且RASAL2的表达与肿瘤的Dukes分期、浸润深度及淋巴结转移密切相关（P＜0.05）。结论RASAL2在结肠癌中的低表达可能与肿瘤的发生、发展和浸润转移等恶性生物学行为相关。

大鼠肉瘤蛋白样激活剂2；结肠癌；实时荧光定量聚合酶链反应；蛋白质印迹；免疫组织化学法

在我国，随着人们生活水平的提高和膳食结构的改变，结肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁国人的生命健康。目前研究认为，癌基因激活及抑癌基因失活与肿瘤的发生、发展密切相关。大鼠肉瘤（rat sarcoma，Ras）是由Ras基因编码且具有鸟苷三磷酸酶活性，其在包括结肠癌在内的多种人类肿瘤中存在异常突变，并广泛参与肿瘤的恶性生物学进程，是最为重要的原癌基因之一[1-2]，大鼠肉瘤蛋白样激活剂2（rat sarcoma protein activator like 2，RASAL2）是一种大鼠肉瘤三磷酸鸟苷（rat sarcoma guanosine triphosphate，RasGTP）酶活性蛋白，其能加快RasGTP酶的活性，关闭Ras信号通路，实施负性调控[3]，现有研究表明，RASAL2在乳腺癌、星形细胞瘤、卵巢癌及肺癌中表达下降，并具有潜在的肿瘤抑制作用[4-7]。目前，关于RASAL2在结肠癌中的研究尚未见报道，本研究通过多种分子生物学方法检测RASAL2在结肠癌中的表达，并探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1标本材料

选取2012年6月-2014年6月本院诊断为结肠癌并行手术切除患者的组织标本共42例，所有标本经病理确诊。其中男性30例，女性12例；中位年龄58.5岁。肿瘤位于近段结肠26例，远端结肠16例。按Duke病理分期：A期12例，B期7例，C期20例，D期3例。按分化程度：高分化10例，中分化18例，低分化14例。按浸润深度：侵及浆膜者29例，未侵及浆膜者13例。经病理证实有淋巴结转移22例，无淋巴结转移20例。同期肿瘤切除后距肿瘤边缘＞5 cm的肠管黏膜为癌旁组织，所有标本在手术切除后立即置于液氮中低温保存。所有病例术前未行放射治疗或化学治疗。42例标本常规行石蜡包埋，另取其中12例新近收集的组织（包括癌及癌旁组织）进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）和蛋白质印迹检测。

1.2主要试剂

Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，RASAL2及GAPDH引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，兔抗人RASAL2多克隆抗体购自英国Abcam公司，鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自美国Proteintech公司，免疫组织化学链霉亲和素-生物素复合物（strept avidin-biotin complex，SABC）试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3实验方法

1.3.1 qRT-PCR按Trizol说明书提取组织样品总RNA，按逆转录试剂盒（Rever Tra Ace qPCR-RT kit，日本TOYOBO公司）说明书二步法合成cDNA，产物保存于-80℃。根据qRT-PCR试剂盒（SYBR Green Realtime PCR Master Mix，日本TOYOBO公司）说明书在荧光定量PCR仪（ABI7500）上进行检测。RASAL2正向引物序列为：5'-TGGGCCGAGAGC TTTCAGTTTTGC-3'，反向引物序列为：5'-TTGCCAC GGTCGCCTGTAGGA-3'；GAPDH正向引物序列为5'-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3'，反向引物序列为5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'。样本中目的基因与内参基因（GAPDH）循环阈值的差异为ΔCT，实验样本与对照样本（正常肠管黏膜组织）ΔCT的差异为ΔΔCT，以2-ΔΔCT表示基因的相对表达量，以上实验重复3次.

1.3.2 蛋白质印迹检测提取组织中的总蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法检测蛋白浓度。30μg蛋白/泳道上样，10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝胶电泳、转膜。5％脱脂奶粉室温封闭1 h，加入RASAL2一抗（1∶800）和GAPDH一抗（1∶5 000）于杂交袋中4℃孵育过夜，含吐温的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（tris buffered saline with tween，TBST）洗膜后二抗（1∶3 000）室温孵育2 h。采用增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）法于凝胶成像系统（Bio-rad）拍照，然后用图像分析软件Image J进行灰度分析，计算目的蛋白与GAPDH的光密度比值。

1.3.4 免疫组织化学染色所有标本用中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，连续4μm厚切片。RASAL2一抗的工作浓度为1∶100，操作步骤按照即用型免疫组织化学SABC检测试剂盒说明书进行，用已知阳性的结肠癌切片作为阳性对照，用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作为阴性对照。免疫组织化学染色由2位高年资病理科医生以盲法观察确定，RASAL2主要为胞浆着色，按照参照文献[8]的判定标准，每张切片随机观察5个高倍镜视野（每个视野计数100个细胞），计算阳性细胞百分率及染色程度，以阳性细胞百分数及细胞染色程度评分的乘积进行综合判断。阳性细胞数＜5％为0分，5％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分；不着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分，结果判定总分≤3为低表达，总分＞3为高表达。

1.4统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，计数资料以率表示，用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1RASAL2 mRNA在结肠癌及癌旁组织中的表达

RT-qPCR检测结果显示，在12对结肠癌组织中有10对（83.3％）癌旁组织的RASAL2 mRNA表达水平高于对应的癌组织（见图1A）；以癌旁组织和癌组织的均值作箱形图，两者RASAL2 mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（P=0.009）（见图1B）。

2.2蛋白质印迹检测

12对结肠癌组织中有10对（83.3％）癌旁组织的RASAL2蛋白（129kD）表达量高于对应的癌组织，差异有统计学意义（P=0.006）。见图2。

图1 qRT-PCR检测结肠癌和癌旁组织中RASAL2 mRNA的表达

2.3RASAL2蛋白在结肠癌及癌旁组织中的表达

图2 蛋白质印迹检测12对结肠癌和癌旁组织中RASAL2蛋白的表达

图3 免疫组织化学法检测RASAL2蛋白在结肠癌和癌旁组织中的表达（SABC×200）

免疫组织化学法染色结果显示，RASAL2在所有癌旁及大部分癌组织中有表达，主要定位于胞浆，呈棕黄色颗粒状分布（见图3）。42例结肠癌组织中RASAL2高表达率为42.9％（18/42），而癌旁组织中RASAL2高表达率为88.1％（37/42），差异有统计学意义（χ2=19.012，P＜0.01）。

2.4RASAL2蛋白表达与结肠癌临床病理特征的相关性

统计学分析发现，RASAL2蛋白表达与患者的年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小及分化程度等无关（P＞0.05）；而与肿瘤的Dukes分期、浸润深度和淋巴结转移有关（P＜0.05）。见附表。

附表 结肠癌临床病理特征与RASAL2蛋白表达的相关性

3 讨论

结肠癌常常起病隐匿且发展快，确诊为早期阶段结肠癌5年生存率＞90％，当有局部淋巴结转移时下降为65％，而有远处转移时则＜10％[9]。这表明侵袭转移是导致结肠癌治疗失败的最主要原因，也是患者致死和影响长期存活的主要因素。目前，研究认为结肠癌的侵袭转移是一个多基因改变和多因素参与的复杂过程，其中癌基因的激活及抑癌基因功能失活在该过程中占主要地位[10-11]。

Ras基因包括H-Ras、K-Ras和N-Ras 3种，K-ras是目前已知最常被激活的原癌基因之一，其基因突变在结肠癌侵袭转移过程中发挥极为重要的作用[12-13]。而最新研究表明，Ras蛋白过度活化及其下游信号通路的调节异常可能与Ras基因抑制物Ras GAP的下调或缺失有关[14-15]。RASAL2是Ras GAPs家族的主要成员之一，近期研究发现其能通过多种途径抑制肿瘤侵袭转移，是潜在的抑癌基因，MCLAUGHLIN等[4]报道RASAL2在原发性乳腺癌中显著低表达，且低表达与患者的预后不良相关。而无论是在乳腺癌细胞系还是动物模型中，抑制RASAL2能激活Ras，从而促进肿瘤的侵袭转移。WEEKS等[5]发现在星形细胞瘤中，RASAL2与上皮细胞转化因子2相互作用共同调节Rho激酶活性，而下调RASAL2表达则会导致星形细胞瘤的恶性转化。在卵巢癌的研究中，HUANG等[6]同样发现RASAL2在肿瘤中表达下调，且与卵巢癌的临床分期及病理分型相关，而RASAL2敲除后能通过活化大鼠肉瘤-细胞外信号调节激酶通路引起卵巢癌细胞发生上皮间质转换，促进肿瘤的侵袭转移。相似的研究结果也在肺癌中被报道[7]。值得注意的是，最新研究发现RASAL2在三阴性乳腺癌中表达上调，且其通过激活Rac1来促进肿瘤的恶性生物学进程，而这种效应并不依赖于Ras GAP酶的催化活性[16]。提示RASAL2在肿瘤中的作用可能与细胞类型及发育背景相关。

目前国内外尚未见RASAL2在结肠癌中的研究报道。本研究结果显示，RASAL2在结肠癌组织中的表达水平较癌旁组织明显减少，提示在结肠癌中RASAL2的活性受到抑制。此外，本研究还发现RASAL2蛋白的表达与结肠癌的Dukes分期、浸润深度及淋巴结转移呈负相关，提示RASAL2可能在结肠癌的进展及侵袭转移过程中发挥重要作用，这与上述研究结果相似。

综上所述，本研究首次发现RASAL2在结肠癌组织中表达下调，且与肿瘤进展及浸润转移相关，其中浸润转移是影响结肠癌患者预后的重要因素。因此，RASAL2也可能成为结肠癌的一个预后判断指标，指导患者的预后生存。但目前RASAL2在肿瘤中所扮演的角色及调控机制还不完全清楚，其在结肠癌中的作用及机制有待进一步研究。

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（童颖丹 编辑）

Clinicopathological significance of expression of Ras protein activator like 2 in colon cancer

Zhen LIAO,Hui NING,Wei LIU,Wei LU
(Department of General and Thoracic Surgery,Central Hospital of Laifeng County,Enshi,Hubei 445700,P.R.China)

【Objective】To evaluate the expression of Ras protein activator like 2(RASAL2)in human colon carcinoma and the corresponding adjacent non-tumor tissues,and to explore the correlation between RASAL2 expression and clinicopathologic characteristics of colon carcinoma.【Methods】The expressions of RASAL2 mRNA and protein in the tumor tissues of 42 cases with colon carcinoma and the corresponding adjacent non-tumor tissues were detected by quantitative real-time PCR,Western blot and immunohistochemistry.The correlation between RASAL2 expression and clinicopathologic characteristics of colon carcinoma was then analyzed.【Results】Quantitative real-time PCR and Western blot analysis showed that the expressions of RASAL2 mRNA and protein in the colon carcinoma tissues were notably lower than those in the corresponding adjacent non-tumor tissues(P＜0.05).Immunohistochemical staining demonstrated that the positive rate of RASAL2 protein expression in the colon carcinoma tissues was significantly lower than that in the adjacent non-tumor tissues(42.9％vs 88.1％;χ2=19.012,P＜0.01),and the expression level of RASAL2 was closely correlated with Dukes stage,invasive depth and lymph node metastasis(P＜0.05).【Conclusions】RASAL2 is down-regulated in colon carcinoma tissues;and it may be involved in the carcinogenesis,development and metastasis of colon carcinoma.

RASAL2;colon cancer;qRT-PCR;Western blot;immunohistochemistry

R735.35

A

1005-8982（2015）35-0043-005

2015-06-30

芦伟，E-mail：weilu_18@163.com