MELAS患者肌细胞线粒体自噬异常的研究

朱暄 张世彬 陈庆国 朱敏 郑俊俊 朱元昭 黄经纬 洪道俊

MELAS患者肌细胞线粒体自噬异常的研究

朱暄 张世彬 陈庆国 朱敏 郑俊俊 朱元昭 黄经纬 洪道俊

目的 探讨线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征(mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke like-episodes，MELAS)患者肌细胞内线粒体自噬异常的改变。方法 纳入2013-01-2014-06在作者医院就诊的7例MELAS患者，所有患者均行骨骼肌活检和线粒体DNA扩增后限制性内切酶基因检测。对患者的肌肉标本进行LC3、Beclin1、Bcl-2、Bax蛋白的免疫组化和免疫印迹检测。结果 患者肱二头肌活检显示肌肉中出现数量不等的破碎肌纤维，表现为破碎红肌纤维和破碎蓝纤维，以及肌间小血管管壁深染。免疫组化染色显示LC3、Bcl-2、Bax蛋白在破碎肌纤维中呈阳性表达，而Beclin1呈阴性表达。肌肉活检组织免疫印迹检测显示LC3-Ⅰ表达升高，而LC3-Ⅱ表达下降；Beclin1表达无改变；Bcl-2和Bax表达升高；LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Bcl-2/Bax比值下降。结论 MELAS病变肌纤维的线粒体存在自噬障碍，造成大量功能和形态异常的线粒体不能被及时清除而堆积在细胞中，进而可导致细胞凋亡。

MELAS；线粒体自噬；LC3；凋亡

线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征(mitochondrial encephalomyopathy，lactic acidosis and stroke like-episodes，MELAS)是最常见的线粒体脑肌病综合征之一，该病主要临床特点为高乳酸血症和卒中样发作[1-2]。目前MELAS的发病机制尚不完全清楚，主要的病因假说为线粒体基因突变后导致线粒体功能障碍，引起细胞能量代谢障碍，影响到骨骼肌、血管平滑肌、神经细胞等主要靶细胞功能[3-4]。

自噬是一种选择性的程序化降解各种细胞底物的生命过程[5]。线粒体自噬主要是指在外界因素的刺激下，损伤的线粒体被包裹进自噬体并被溶酶体融合，从而降解损伤的线粒体，维持细胞内环境的稳定[6]。目前大量研究表明线粒体自噬与神经系统变性病相关，特别是和帕金森病的发病密切相关[7]。然而，目前关于MELAS患者骨骼肌细胞内线粒体自噬的研究相对缺乏。本研究观察了7例MELAS患者肌细胞内自噬相关因子的表达情况。

表 1 MELAS患者主要临床特点

1 对象和方法

1.1 对象 选取2013-01-2014-06在南昌大学第一附属医院神经科确诊为MELAS患者7例，其中男4例，女3例，平均发病年龄(25.9±11.7)岁。其主要临床特点见表1。3例患者肌酸磷酸激酶升高，最高达5233U/L(正常参考值5～171 U/L)。7例患者头颅MRI均出现脑皮质区异常信号影，主要累及大脑半球的颞、顶、枕叶，受累病灶不符合血管支配特点。3例患者行磁共振波谱分析，2例患者发现乳酸双峰。经限制性内切酶法检测患者肌肉线粒体DNA，均发现致病突变。

1.2 方法

1.2.1 肌肉病理染色：经患者知情同意及南昌大学第一附属医院伦理委员会的批准，对7例患者进行肌肉活体组织检查，均取自左侧肱二头肌。肌肉标本经异戊烷预冷后，液氮中冷冻固定，对冷冻切片常规进行组织学和酶组织化学染色：苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)、改良Gommri染色(modified gomori trichrome, MGT)、油红O染色、PAS染色(periodic acid-schiff，PAS)、还原型辅酶I四唑蓝还原酶染色、琥珀酸脱氢酶染色(succinate dehydrogenase，SDH)、细胞色素C染色、非特异脂酶染色。免疫组织化学染色采用En-Vision二步法，第一抗体分别为兔LC3单克隆抗体(1∶100，Cell Signaling公司，#12741)、兔Beclin1多克隆抗体(1∶200，Abcam公司，ab55878)、鼠Bcl-2单克隆抗体(北京中杉试剂)、鼠Bax单克隆抗体(北京中杉试剂)。同时选取同期2例拟诊神经肌肉病而肌肉活检正常的患者作为正常对照。

1.2.2 Western blot检测：MELAS患者肌肉活检组织，匀浆后制取蛋白免疫印迹检测标本。测采用Bio-Rad电泳系统，浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为12%。每个泳道总蛋白上样量为50 g，电压为40 V，30 min；60 V，1～2 h。电泳完毕，将凝胶用200 mA转移2 h至PVDF膜上，一抗分别为LC3 (1∶1000)、Beclin1 (1∶1000)、Bcl-2 (1∶100)、Bax (1∶100)，4℃孵育过夜。ECL试剂盒荧光显影。上述检测重复进行3次。由于肌肉标本数量限制，本组3例A3243G突变(患者2、6、7)和1例G13513A突变(患者4)的肌肉标本用于蛋白检测，1例正常肌肉标本作为对照。

2 结果

2.1 病理结果 7例患者肌肉活检HE染色显示肌肉组织出现不等数量的破碎样肌纤维，其内出现嗜碱性颗粒沉积；MGT染色显示破碎样肌纤维表现为典型的或不典型的破碎红肌纤维(ragged red fiber，RRF)；SDH染色显示破碎样肌纤维显著深染，呈破碎蓝纤维(ragged blue fiber，RBF)；4例患者出现肌间小血管管壁深染(stained succinate dehydrogenase vessels，SSV)；细胞色素C染色显示存在RBF的患者出现肌纤维膜下深染及阴性肌纤维。具体结果见图1。

免疫组化染色结果显示，LC3蛋白、Bcl-2蛋白和Bax在A3243G突变患者和G13513A突变患者的RRF或个别萎缩肌纤维中呈阳性表达，而正常对照肌纤维内未见阳性表达。Beclin1蛋白在MELAS患者的肌纤维和正常对照肌纤维中均未见明显阳性表达。具体结果见图2。

2.2 蛋白表达改变 3例A3243G患者和1例G13513A突变患者肌纤维内LC3-Ⅰ表达水平较对照升高，而LC3-Ⅱ表达水平与对照组比较未明显升高，半定量分析显示LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值并未升高逆转。MELAS患者Beclin1蛋白水平与对照比较无明显改变。Bcl-2蛋白和Bax蛋白在A3243G突变和G13513A突变患者肌纤维内均较对照升高，半定量分析显示MELAS患者肌细胞内Bcl-2/Bax<1。结果见图3。

图1 MELAS患者(例2)肱二头肌活检结果显示肌肉组织中出现破碎样肌纤维，其内出现嗜碱性颗粒沉积(HE染色，A)；破碎样肌纤维表现为典型的破碎红肌纤维(改良Gomri染色，B)；破碎样肌纤维显著深染(琥珀酸脱氢酶染色，C)；例6患者肱二头肌活检显示肌间小血管管壁深染(琥珀酸脱氢酶染色，D)

图2 MELAS患者肱二头肌活检免疫组化染色显示LC3蛋白、Bcl-2蛋白及Bax在A3243G和G13513A突变者的破碎肌纤维中呈阳性表达，而正常对照未见明显阳性表达；Beclin1蛋白在A3243G、G13513A患者和正常对照中均未见明显阳性表达

3 讨论

MELAS综合征患者临床表型具有很大的异质性，主要以脑卒中样发作、癫痫、肌无力、智力障碍、头痛等常见，还可出现精神异常、发育迟缓、耳聋、视力下降、糖尿病等[8-9]。本组7例患者均为先证者，尽管患者之间临床表现存在一定差异，但均表现为突出的神经系统受累症状。然而在本组部分家系患者仅表现为糖尿病、听力下降、身材矮小、心脏病变、肌无力等孤立症状，这与文献报道结果相似[2]。因而在询问MELAS患者的家族史时，需要对任何一种异常体征和症状具有警惕性。

1：对照组；2～4：A3243G突变患者；5：G13513A突变患者

图3 MELAS患者免疫印迹检测肌肉蛋白表达水平

影像学检查可为MELAS诊断提供重要线索。文献报道，急性期患者行头颅MRI检查时，颞、顶、枕叶多可见广泛高信号，易与脑梗死混淆[10]。本组7例患者头MRI检查结果亦主要表现为颞、顶、枕叶异常信号，且有2例患者出现小脑病变，该7例患者颅内病灶均以皮层和皮层下白质受累为主，不符合血管分布。部分MELAS患者行磁共振波谱分析可见病灶区乳酸水平增高而出现典型的乳酸峰，乳酸峰以在1.33 ppm附近出现双乳酸峰，回波时间设定为144 ms时双乳酸峰倒置为其特征[11]。该组3例患者行磁共振波谱分析，其中2例患者发现乳酸双峰，故波谱分析是诊断MELAS的重要手段。

目前已报道有30多个mtDNA突变可导致MELAS，其中A3243G点突变约占80%[12]。本组7例患者中检测到A3243G点突变6例。G13513A突变所致的MELAS近年逐渐受到重视，是国内第二常见的MELAS突变位点[13]。G13513A突变主要可引起MELAS、Leigh及MELAS-Leigh叠加综合征，据报道这些临床表型与年龄有一定关系[14]。mtDNAG13513A突变引起的MELAS综合征多见于成年人，其所致的Leigh综合征多见于婴幼儿，而MELAS-Leigh叠加综合征非常罕见。本组病例发现1例G13513A突变，该例患者36岁起病，主要表现为MELAS综合征症状，与相关文献报道结果相符。

线粒体自噬是细胞控制线粒体数量以及清除受损线粒体的唯一途径，当细胞内的线粒体功能发生障碍时，细胞将启动线粒体自噬过程，选择性清除功能受损的线粒体[6]。MELAS的肌肉病理研究表明RRF、RBF、SSV中存在大量代偿性增生并聚集的异常线粒体[2]，提示在MELAS的肌细胞中存在自噬不足。本研究发现，这些线粒体异常聚集的肌细胞内存在LC3阳性表达，但自噬调控蛋白Beclin1表达阴性，免疫印迹进一步证实了Beclin1蛋白表达未升高，LC3表达升高以LC3-Ⅰ为主，而自噬活性蛋白LC3-Ⅱ并未升高，因而从分子水平上证实肌细胞内线粒体自噬水平低下。LC3是细胞自噬通路过程的膜识别分子，LC3-Ⅱ特异性地结合到新合成的自噬体上，因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值代表细胞自噬水平[15]。Beclin1通过与磷脂酰肌醇3-激酶形成复合体诱导自噬相关蛋白定位于自噬体膜，进而调节自噬活性，其表达强度与自噬的活性密切相关[16]，通过检测Beclin1表达，可对自噬的活性进行监测和判断。根据本研究结果推测MELAS病变肌纤维内线粒体的自噬过程可能被启动(LC3-Ⅰ显著升高)，但在随后的自噬调控过程中出现异常，导致线粒体自噬障碍(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ下降和Beclin1阴性)。

Bcl-2是一种细胞抑制凋亡蛋白，而Bax是一种促凋亡蛋白，这两种蛋白主要分布在线粒体[17]。本研究结果显示MELAS破碎肌纤维中出现Bcl-2和Bax蛋白阳性表达，免疫印迹进一步证实此两种蛋白表达上调，且Bcl-2/Bax比值小于1，提示这些线粒体自噬障碍的破碎肌纤维通过凋亡途径死亡。这与既往文献报道MELAS患者的骨骼肌内存在细胞凋亡过程的异常过度激活相一致[18]。此外Bcl-2能够通过调节线粒体膜的通透性来调节线粒体自噬，其与Beclin1有相似的结构域，Bcl-2通过该域与Beclin1作用从而抑制自噬[19]，提示MELAS病变肌纤维内线粒体自噬异常和细胞凋亡之间存在相互作用。

目前L-精氨酸已经在MELAS患者的急性期治疗中发挥重要作用[20]，此外多种氧化呼吸链调节物组成的“鸡尾酒疗法”也在临床得到推广，但MELAS患者的总体预后尚不理想[21]。MELAS病变肌纤维的线粒体存在自噬障碍，造成大量功能和形态异常的线粒体不能及时清除而堆积在细胞中，进一步加重了细胞的功能障碍，造成细胞凋亡。如果能在线粒体自噬异常以及针对调节线粒体自噬药物方面的研究取得进展，或许对MELAS的治疗带来新的希望。

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(本文编辑：时秋宽)

The dysfunction of mitophagy in the myofibers of patients with MELAS

ZHUXuan,ZHANGShibin,CHENQingguo,ZHUMin,ZHENGJunjun,ZHUYuanzhao,HUANGJingwei,HONGDaojun*.

*DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China

HONG Daojun，Email：hongdaojun@hotmail.com

Objective To explore the dysfunction of mitochondrial autophagy in patients with mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke like-episodes (MELAS). Methods Seven patients with MELAS were collected in our clinical center from January 2013 to June 2014. All the patients underwent muscle biopsy. The mitochondrial DNA (A3243G and G13513A) was amplified by polymerase chain reaction (PCR). Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3), Beclin1, B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), and Bcl-2-associated X (Bax) proteins in muscle specimens were detected by immunohistochemistry and Western blot. Results Muscle biopsy showed that ragged red fibers, ragged blue fibers, and stained succinate dehydrogenase (SDH) vessels presented in affected myofibers. Immunohistochemical staining showed that the ragged fibers had strong immunopositivity to LC3, Bcl-2 and Bax, but negative to Beclin1. Western blot revealed increased level of LC3-Ⅰ; decreased level of LC3-Ⅱ; unchanged level of Beclin1; increased level of Bcl-2 and Bax; and decreased ratios of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and Bcl-2/Bax in the detected muscles. Conclusions Dysfunction of mitochondrial autophagy can be observed in myofibers of MELAS, which makes the affected myofibers transfer to apoptosis pathway.

MELAS; mitochondrial autophagy; LC3; apoptosis

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.05.004

江西省自然科学基金(20142BAB205027)江西省教育厅科技项目(GJJ13128)

330006南昌大学第一附属医院神经科(朱暄、朱敏、郑俊俊、朱元昭、黄经纬、洪道俊)；江西省玉山县中医院(张世彬)；江西省高安市人民医院(陈庆国)

洪道俊，Email：hongdaojun@hotmail.com

R746.9

A

1006-2963 (2015)05-0320-05

2015-04-03)