含Ⅲ型纤连蛋白域蛋白5真核表达载体的构建及初步功能研究

魏飞宇， 成 燕， 李 进， 肖俊杰， 周 蕾

(1. 南京医科大学第一附属医院心脏内科，南京 210029； 2. 同济大学附属同济医院心身科，上海 200065；3. 上海大学生命科学学院，上海 200444)



·基础研究·

含Ⅲ型纤连蛋白域蛋白5真核表达载体的构建及初步功能研究

魏飞宇1， 成 燕2， 李 进3， 肖俊杰3， 周 蕾1

(1. 南京医科大学第一附属医院心脏内科，南京 210029； 2. 同济大学附属同济医院心身科，上海 200065；3. 上海大学生命科学学院，上海 200444)

目的 构建含小鼠FNDC5基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-FNDC5，并初步探索其对C2C12肌细胞的线粒体能量代谢的影响。方法 应用反转录-聚合酶链反应法从小鼠腓肠肌和心脏组织中扩增出两端带有HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点的FNDC5编码片段，经回收、纯化酶切后，依次连接到质粒PMD19-T和pEGFP-C3上，获得过表达载体后转染至C2C12肌细胞，48h后以激光共聚焦显微镜拍摄线粒体荧光强度，以荧光定量PCR检测与线粒体能量代谢相关的基因PGC-1β、ATPase6、ND1和ND6的表达情况。结果 PCR及测序结果表明: 重组质粒pEGFP-C3含有FNDC5段，方向及大小正确，过表达FNDC5可以增强线粒体荧光强度，并增加线粒体能量代谢相关的基因PGC-1β、ATPase6、ND1和ND6的表达。结论 成功构建了小鼠真核表达载体pEGFP-C3-FNDC5，过表达FNDC5可以增强线粒体能量代谢。

FNDC5基因； 真核表达载体； 质粒构建； 线粒体； 能量； 小鼠

含Ⅲ型纤连蛋白域蛋白5(fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5，FNDC5)是一个由FNDC5基因编码的，由1个单一的肽段、2个纤连蛋白区域和1个疏水的区域组成的跨膜的、C末端可以剪切修饰的蛋白[1]。FNDC5的1个剪切分泌体，鸢尾素(Irisin)最初被发现在运动中被剪切下释放到血流中，驱动褐色脂肪细胞形成，抵御肥胖和糖尿病等疾病[1]。研究提示鸢尾素和肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗的发生相关[2-5]。运动、寒颤反应等也可以产生鸢尾素[4-5]。由于鸢尾素的存在目前尚存在争议[6]，本研究更关注FNDC5基因。FNDC5不仅仅存在于骨骼肌，心肌、脑和脊髓也是它最丰富表达的器官之一[2]。骨骼肌和心肌是产生鸢尾素的最主要的脏器之一[7-8]，鸢尾素可以增强骨骼肌细胞的能量代谢[9]，但过表达FNDC5是否可以增强肌细胞的能量代谢尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株及试剂

PMDT19载体、反转录试剂盒、限制性内切酶、Taq酶购自日本TaKaRa公司，pEGFP-C3载体和TOP10感受态大肠杆菌由上海大学再生与衰老实验室提供，RNA抽提试剂盒购自德国QIAGEN公司，引物由上海生工公司合成，测序分析由上海睿迪公司完成。

1.2 引物设计

在NCBI 中找到小鼠FNDC5基因(Gene ID: 384061)的CDS序列，利用Primer premier 5.0软件设计引物，上游引物: 5′-AAGCTTATACACC-CCGGGTCGCCGA-3′(含Hind 3酶切位点，划线部分为酶切位点)，下游引物: 5′-GAATTCTCATAT-CTTGCTGCGGAGAAGCC-3′(含EcoR 1酶切位点，划线部分为酶切位点)。

1.3 小鼠FNDC5基因的扩增与纯化

1.3.1 反转录反应 用QIAGEN试剂盒提取小鼠腓肠肌与心脏的总RNA，利用TaKaRa Prime ScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录出cDNA，-20℃保存备用。

1.3.2 PCR反应体系 超纯水34μl，10×buffer 5μl，MgSO42μl，引物各1μl，cDNA 1μl，dNTP 5μl，Taq酶1μl。反应条件: 94℃预变性4min，94℃变性30s，63℃退火30s，68℃延伸60s，共35个循环，68℃延伸10min。

1.3.3 产物的鉴定与回收 PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，通过条带所在位置表示的大小判断目的条带，用凝胶回收试剂盒回收纯化相应大小的条带。

1.4 克隆载体PMDT-FNDC5的构建及其鉴定

将凝胶回收的产物经过加A反应(目的片段30μl，超纯水13μl，10×buffer 5μl，rTaq 1μl，dNTP 1μl，反应体系: 72℃延伸30min)后，用PCR产物清洁试剂盒纯化。将所得产物和PMDT19载体16℃连接过夜。将连接产物PMDT-FNDC5转化感受态大肠杆菌TOP10，进氨苄(Amp+)抗性筛选，随机挑选能够生长出来的菌落抽提质粒进行PCR，双酶切鉴定(Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ)及送测序公司测序。

1.5 真核表达载体pEGFP-C3-FNDC5的构建与鉴定

小量提取pEGFP-C3空质粒，用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定，凝胶回收纯化，得到pEGFP-C3双粘性末端质粒。再用Hind Ⅲ 和EcoR Ⅰ双酶切验证正确的PMDT-FNDC5质粒，回收纯化目的片段FNDC5的双粘性末端的片段。将回收纯化的目的片段与双粘性质粒pEGFP-C3质粒用T4连接酶连接。转化后，卡那霉素筛选出能够生长转化子，随机选取进行PCR，测序验证。

1.6 荧光定量PCR检测

转染构建的质粒48h后，进行荧光定量PCR检测。采用miRNeasy Mini Kit(德国凯杰)进行总RNA的提取，按下列组分配制反转录反应液(配制过程均在冰上完成): 5×reverse transcriptase mix 2μl， RNA 样本400ng，补足去核糖核酸酶水至10μl。反转录反应的条件如下: 37℃ 15min，85℃ 5s，4℃持续。实时荧光定量PCR反应: SYBR®Green 10μl，PCR正向引物(10μmol/L)1μl，PCR反向引物(10μmol/L)1μl，cDNA模板2μl和去核糖核酸酶水6μl。反应条件: 95℃预变性3min；95℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s，共40个循环，以TBP为内参。

引物序列如下。m-FNDC5-上游引物: 5′-TTGCCATCTCTCAGCAGAAGA-3′; m-FNDC5-下游引物: 5′-GGCCTGCACATGGACGATA-3′; m-PGC-1β-上游引物: 5′-TCCTGTAAAAGCCCGG-AGTAT-3′; m-PGC-1β-下游引物: 5′-GCTCTGGT-AGGGGCAGTGA-3′; m-ND1-上游引物: 5′-CTCA-ACCTAGCAGAAACAAACC-3′; m-ND1-下游引物: 5′-GGCCGGCTGCGTATTCTAC-3′; m-ND6-上游引物: 5′-TTGGGAGATTGGTTGATGTAT-3′; m-ND1-下游引物: 5′-TGCCGCTACCCCAATCC-3′; m-ATPase6-上游引物: 5′-TCGTTGTAGCCATCATT-ATATTTCCT-3′; m-ATPase6-下游引物: 5′-GAAA-GAATGGAGACGGTTGTTGA-3′;m-TBP-上游引物: 5′-AGAACAATCCAGACTAGCAGCA-3′; m-TBP-下游引物: 5′-GGGAACTTCACATCACAGCTC-3′。

1.7 线粒体含量染色

转染构建的质粒48h后，向细胞培养液中加入线粒体红色荧光探针-MitoRed 200nmol/L(南京凯基生物)和Hoechst(锐博生物)37℃孵育45min，封片后，用激光共聚焦显微镜(德国，Zeiss)采集图像。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1FNDC5基因片段的扩增

RT-PCR扩增，获得FNDC5大小与预期大小(630bp)相符，见图1。在腓肠肌组织和心脏组织样本中条带清晰，空白对照组无条带。

2.2 重组质粒PMDT-FNDC5的筛选鉴定

克隆载体PMDT-FNDC5以FNDC5的引物进行PCR得到产物的大小与预期大小完全相符，见图2A。HindⅢ和EcoRⅠ双酶切克隆载体PMDT-FNDC5产物: 可见条带位于3000bp附近的线状质粒和700～500bp之间的目的条带，见图2B。重组质粒经公司测序证实所得的FNDC5片段与NCBI收录的FNDC5片段完全一致，见图3。

图1 FNDC5基因RT-PCR产物电泳图Fig.1 PCR products of FNDC5M: DL1000 DNA marker；1: 空白对照；2: 心脏组织中FNDC5片段；3: 空白对照4: 腓肠肌组织中FNDC5片段

图2 重组质粒PMDT-FNDC5的PCR产物电泳图和经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切结果Fig.2 The PCR products of FNDC5 and results of vectors double digestion from recombinant plasmid PMDT-FNDC5A： 重组质粒PMDT-FNDC5的PCR产物电泳图；M: DL1000 DNA marker；1～4: PMDT-FNDC5 PCR产物结果；B： 重组质粒PMDT-FNDC5经Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切结果；0: 未被酶切的质粒；M1: DL5000 DNA marker；M2: DL1000 DNA marker；1～6: PMDT-FNDC5被Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切

图3 重组质粒PMDT-FNDC5测序结果Fig.3 Sequencing results of recombinant plasmid PMDT-FNDC5

2.3 重组质粒pEGFP-C3-FNDC5的筛选鉴定

从卡那霉素的平板上挑选转化子，抽提质粒后，克隆载体pEGFP-C3-FNDC5以FNDC5的引物进行PCR得到产物的大小与预期大小完全相符，见图4。

图4 重组质粒pEGFP-C3-FNDC5的PCR产物电泳图Fig.4 PCR products of pEGFP-C3-FNDC5M1: DL1000 DNA marker；1、2: pEGFP-C3-FNDC5 PCR产物结果；3、4: 阴性对照；M2: DL5000 DNA marker

重组质粒经公司测序证实所得的FNDC5片段与NCBI收录的FNDC5片段完全一致，见图5。

2.4 重组质粒pEGFP-C3-FNDC5可以过表达FNDC5

在C2C12肌细胞转染重组质粒48h后，细胞显示绿色荧光，见图6。以荧光定量PCR检测发现，FNDC5过表达组中与对照组相比，FNDC5被显著上调(1.02±0.0860vs4208.6±20.08,P<0.01)。

2.5 过表达FNDC5可以增加线粒体含量

转染过表达载体或者对照载体至C2C12肌细胞，48h后以激光共聚焦显微镜拍摄线粒体荧光强度，发现过表达FNDC5可以显著增强线粒体荧光强度，见图7。与对照组相比，FNDC5过表达组C2C12肌细胞中线粒体荧光强度显著增强(5.965±0.0032vs17.59±1.03，P<0.01)。

2.6 过表达FNDC5可以增强线粒体能量代谢相关基因的表达

转染过表达载体或者对照载体至C2C12肌细胞，48h后提取总RNA，以荧光定量PCR检测与线粒体能量代谢相关的基因PGC-1β、ATPase6、ND1和ND6的表达情况，发现过表达FNDC5可以显著增加线粒体能量代谢相关的基因PGC-1β、ATPase6、ND1和ND6的表达，见图8。

图5 重组质粒pEGFP-C3-FNDC5测序结果Fig.5 Sequencing results of recombinant plasmid pEGFP-C3-FNDC5

图6 重组质粒pEGFP-C3-FNDC5可以过表达FNDC5Fig.6 The recombinant plasmid pEGFP-C3-FNDC5 can induce FNDC5 overexpressionA： 对照组；B： FNDC5过表达组

图7 过表达FNDC5可以增加线粒体含量Fig.7 The over-expressed FNDC5 can increase the content of mitochondrialA： 对照组；B： FNDC5过表达组；标尺长度: 10μm；红色荧光代表线粒体，蓝色荧光代表细胞核

图8 过表达FNDC5可以增强线粒体能量代谢相关基因的表达Fig.8 Over-expression FNDC5 enhances the expression of mitochondrial energy metabolism-related genes与对照组相比，*P<0.05

3 结 论

FNDC5最早于2002年由两个不同的课题组发现，一个是基于对于含Ⅲ型纤连蛋白域蛋白的基因组扫描所发现[10]，而另外一个是基于扫描过氧化物酶蛋白的扫描所发现[11]。但是，FNDC5的功能研究长期为人们所忽视。

鸢尾素的研究目前在学界充满着争议，一方学者认为运动可以增加循环鸢尾素的表达，且鸢尾素可以促进脂肪细胞褐色化，可以治疗肥胖和糖尿病[1]。同时，鸢尾素可以激活大脑中的神经保护因子，如BDNF等，可能具有潜在的治疗阿尔茨海默病的作用[6]。但是，另一方学者却认为，所有的现在使用的检测鸢尾素的ELISA试剂盒并没有经过验证，事实上，鸢尾素并不存在[7]。

无论鸢尾素存在与否，FNDC5的功能研究尚属于相对空白。FNDC5在肌肉组织、心脏组织和脑组织中具有很高的表达水平。运动训练可以使得肌肉和脑组织中的FNDC5表达增加，FNDC5的单核苷酸多态性与骨骼肌细胞的糖代谢调控相关[7,12]。过表达FNDC5可以促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化[13]，也有研究证实FNDC5有促进胚胎干细胞向神经元分化的作用[14]。鸢尾素被报道可以增强骨骼肌细胞的能量代谢[9]，但是过表达FNDC5是否可以增强肌细胞的能量代谢尚不清楚。本研究初步提示过表达FNDC5可以增强肌细胞的能量代谢，主要体现在线粒体含量的增加以及与线粒体能量代谢相关的基因PGC-1β、ATPase6、ND1和ND6的表达的增加。

本研究成功构建了pEGFP-C3-FNDC5表达载体，并初步提示过表达FNDC5可以增强线粒体能量代谢，为下一步深入探索FNDC5在肌细胞中的作用奠定了一定的基础。

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Construction and preliminary functional studies of Fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5 eukaryotic expression vector

WEIFei-yu1,CHENGYan2,LIJin3,XIAOJun-jie3,ZHOULei1

(1. Dept. of Cardiology, The First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029,China; 2. Dept. of Psychiatry, Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200065, China；3. School of Life Science, Shanghai University, Shanghai 200444, China)

Objective To construct eukaryotic expression vector pEGFP-C3-FNDC5 and to investilate its role in regulating mitochondrial biogenesis in C2C12 myocytes. Methods The cDNA coding sequence ofFNDC5 containing digest siteHindⅢ andEcoRⅠ was amplified by RT-PCR from gastrocnemius muscle and heart tissue of mice, and was then inserted into PMD19-T vector and pEGFP-C3 vector. The recombined plasmid was identified by PCR and further sequenced. After transfection of vector for 48h, mitochondrial content was measured by confocal microscopy and genes regulating mitochondrial biogenesis was determined by quantitative Real-Time polymerase chain reaction(qRT-PCR). Results PCR and DNA sequencing results showed that the recombinant plasmid pEGFP-C3-FNDC5 contained the fragment ofFNDC5.FNDC5 overexpression enhanced mitochondrial content and also increased the expression of PGC-1β, ATPase6, ND1 and ND6. Conclusion The eukaryotic expression vector pEGFP-C3-FNDC5 has been constructed successfully.FNDC5 overexpre-ssion can enhance mitochondrial biogenesis.

FNDC5 gene; eukaryotic expression vector; vector construct; mitochondrial; energy; mice

10.16118/j.1008-0392.2015.04.004

2015-03-17

国家自然基金青年项目(81400885)

魏飞宇(1988—),男，硕士研究生.E-mail: nanjingweifeiyu@163.com

周 蕾.E-mail: nanjingzhoulei@163.com

R 3

A

1008-0392(2015)04-0019-06