硝苯地平对人牙龈成纤维细胞MMP-1和MMP-2 mRNA表达的影响

陈龙杰， 杨 俊， 李午丽， 赵守亮

(1. 同济大学附属口腔医院牙体牙髓科，上海 200072；2. 同济大学口腔生物医学及转化医学实验室，上海 200072;3. 复旦大学附属华山医院口腔科，上海 200040)



·基础研究·

硝苯地平对人牙龈成纤维细胞MMP-1和MMP-2 mRNA表达的影响

陈龙杰1，2， 杨 俊1，2， 李午丽1，2， 赵守亮1,3

(1. 同济大学附属口腔医院牙体牙髓科，上海 200072；2. 同济大学口腔生物医学及转化医学实验室，上海 200072;3. 复旦大学附属华山医院口腔科，上海 200040)

目的 探讨硝苯地平(Nifedipine)对人牙龈成纤维细胞(gingival fibroblasts, GFs)基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)mRNA表达的影响。方法 取牙周手术切除的健康牙龈组织，组织块法分离及培养获得GFs,免疫细胞化学法对GFs进行鉴定。对GFs进行药物刺激，分为硝苯地平组(1μg/ml)、LPS组(1μg/ml)、硝苯地平+LPS组(分别为1μg/ml)，同时设空白对照组。实时定量PCR检测各组24、48h时MMP-1和MMP-2 mRNA的表达水平。结果 组织块法获得的GFs生长状态良好；免疫细胞化学显示，GFs抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性。与空白对照组相比，硝苯地平组刺激48h后MMP-1、MMP-2 mRNA表达减少(P<0.05)；硝苯地平+LPS组MMP-1 mRNA表达明显增加(P<0.05)，MMP-2 mRNA表达无明显变化。结论 硝苯地平可能通过影响GFsMMP-1和MMP-2基因的表达而影响牙龈增生。

牙龈成纤维细胞； 硝苯地平； 脂多糖； 基质金属蛋白酶

硝苯地平(nifedipine)作为一种钙通道阻滞剂，被广泛应用于心绞痛、高血压等心血管疾病的治疗，其不良反应之一是牙龈增生[1-2]，但其引起牙龈增生的机制目前尚不清楚。增生的牙龈组织以纤维化和不同程度的炎症浸润为特点[3]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类Ca2+、Zn2+依赖酶，在细胞外基质代谢调节、纤维化等过程中起重要作用[4]。炎症作为牙龈增生的促进因素之一，其中细菌脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)可能发挥重要作用。本研究以硝苯地平刺激人牙龈成纤维细胞，体外模拟炎症环境，观察硝苯地平对GFs MMP-1和MMP-2基因表达的影响，初步探讨硝苯地平在体外正常及炎症环境下诱导牙龈增生的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司；2.5g/L胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；分散酶(dispaseⅡ)购自日本Roche公司；硝苯地平、LPS购自美国Sigma公司；小鼠抗人单克隆Vimentin抗体、广谱角蛋白抗体购自中国凯基公司；CO2恒温细胞培养箱购自日本Sanyo公司；低温高速离心机购自中国Eppendorf公司；倒置相差显微镜购自日本Nikon公司；LightCycler 96实时荧光定量PCR仪购自日本Roche公司。

1.2 人牙龈成纤维细胞原代培养

1.2.1 标本采集及处理 选择来同济大学附属口腔医院牙周科就诊、无高血压及其他系统性疾病、未曾服用致药物性牙龈增生的相关药物、需进行牙周手术治疗的患者。经患者知情同意后，采集冠延长术切除的牙龈组织，置于含双抗的PBS液中。将组织清洗3次，剪切标本为2mm×3mm×3mm的小块，加入2.5g/L分散酶，4℃消化，16～18h后进行原代培养。

1.2.2 人牙龈成纤维细胞原代培养 用组织镊分离上皮与结缔组织，取分离出的结缔组织，用PBS清洗后接种于T25培养瓶，加入适量含100ml/L FBS的DMEM培养基，置5% CO2、37℃培养箱培养。4h后翻瓶。培养13～14d后细胞铺满瓶底约90%，以1∶1传至10cm培养皿培养。自第2代起，当细胞达80%～90%融合时，以1∶3或1∶4传代至10cm培养皿培养。第4～7代细胞用于后续实验研究。

1.3 人牙龈成纤维细胞鉴定

取生长良好的GFs，做盖玻片细胞爬片，多聚甲醛固定30min,PBS洗3次，每次5min；1ml/L Triton X-100处理15min，PBS洗3次，每次5min；滴加30ml/L过氧化氢以阻断内源性过氧化物酶；5%BSA封闭20min后滴加小鼠抗人单克隆Vimentin抗体和CK抗体(1∶200)，阴性对照组滴加PBS。玻片置湿盒内，4℃过夜。次日取出玻片，室温静置1h，加二抗，室温孵育30min，滴加DBA显色液，苏木素复染，脱水、透明，晾干后中性树胶封片，倒置相差显微镜拍照。

1.4 实时定量PCR检测GFsMMP-1和MMP-2 mRNA的表达

1.4.1 样本制备及实验分组 取生长良好的GFs，0.5g/L胰酶消化后计数，用含100ml/L FBS的培养基调整细胞浓度为1×105/ml，分别接种于6孔板，每孔2ml。待细胞融合约70%时，更换为基础培养基(含20ml/L FBS)。继续培养24h后，分别加入不同药物进行刺激: 硝苯地平组(1μg/ml)，LPS组(1μg/ml)，硝苯地平+LPS组(分别为1μg/ml)，以上溶液均以基础培养基配制，以不含任何药物的基础培养基为空白对照组。药物分别作用24、48h后，吸去培养液，每孔加入TRIzol 1ml,冰上裂解10min，收集混合液于1.5ml EP管，-80℃冻存备用。

硝苯地平药液配制: 硝苯地平以无水乙醇为溶剂配成10-2mol/L的原液，-20℃避光保存。使用时以培养基稀释成1μg/ml的工作液，4℃避光保存，1周内使用。

脂多糖药液配制: 将1mg LPS完全溶解于1ml生理盐水中，获得1mg/ml LPS原液，-20℃保存。使用时用培养基稀释成1μg/ml 的工作液，4℃避光保存，1周内使用。

1.4.2MMP-1、MMP-2基因表达的实时定量PCR检测 TRIzol法提取细胞总RNA，每个样本取1μg RNA，使用Roche反转录试剂盒合成cDNA，进行实时定量PCR反应。反应条件如下: 95℃,预变性600s；变性95℃,10s;退火60℃,10s;延伸72℃，20s;PCR反应40个循环;溶解曲线分析95℃，10s;65℃,60s;97℃,1s。用软件Primer Premier 6设计引物，见表1。

表1 引物序列Tab. 1 Sequences of primers

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0软件对数据进行方差分析，多重比较用LDS-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 GFs体外细胞培养

采用组织块法进行GFs原代培养，5～6d后有细胞从组织块周围爬出，13～14d待细胞大量融合后进行传代。倒置显微镜下观察，细胞呈长梭形或星形。原代培养的细胞以组织块为中心生长，传代后的细胞呈放射状或漩涡状走形，排列紧密，见图1。

图1 人牙龈成纤维细胞培养Fig.1 The culture of GFs(×100)A： 原代HGFs；B： 第4代HGFs

2.2 GFs细胞鉴定结果

本实验所获得的GFs抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性，证明细胞为中胚层来源，见图2。

图2 人牙龈成纤维细胞免疫细胞化学鉴定结果Fig.2 The result of immunocytochemistry for GFs(×100)A: 细胞抗波形丝蛋白染色阳性；B： 细胞抗角蛋白染色阴性

2.3 硝苯地平对GFsMMP-1、MMP-2 mRNA表达的影响

与对照组相比，硝苯地平作用24h时，MMP-1 mRNA表达量无明显变化，48h时MMP-1 mRNA表达明显减少(P<0.05)；LPS组及硝苯地平+LPS组，MMP-1 mRNA的表达量随时间延长而减少，但均比对照组表达增加(P<0.05)，见图3。

与对照组相比，硝苯地平组MMP-2 mRNA表达减少，且48h时差异有统计学意义(P<0.05)；硝苯地平+LPS组MMP-2 mRNA表达减少，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

图3 硝苯地平对GFs MMP-1 mRNA表达的影响Fig.3 The effect of nifedipine on the mRNA expression of MMP-1与对照组相比，*P<0.05

图4 硝苯地平对GFs MMP-2 mRNA表达的影响Fig.4 The effect of nifedipine on the mRNA expression of MMP-2 与对照组相比，*P<0.05

3 讨 论

药物性牙龈增生(drug-induced gingival overgrowth, DIGO)是指长期服用某种药物而引起的牙龈组织过度生长和体积增大。组织病理学发现: 硝苯地平引起的牙龈增生以细胞外基质增多，特别是Ⅰ型胶原和不同程度的炎症浸润为特点[5-6]。研究认为，胶原的过度堆积可能与MMP及其抑制剂之间的失衡而引起胶原合成增加或降解减少有关。但硝苯地平引起牙龈增生的分子机制目前尚不清楚，故本实验将硝苯地平作用于牙龈成纤维细胞，并加入LPS作为炎症刺激，观察正常及炎症环境下，硝苯地平对牙龈成纤维细胞MMP-1和MMP-2基因表达的影响，初步探讨硝苯地平诱导牙龈增生的分子机制。

MMPs是一类Ca2+、Zn2+依赖酶，在细胞外基质的代谢调节、纤维化等过程中起重要作用[4]。迄今为止发现的MMPs至少有28种[7-8]，根据其结构和作用底物的特性分为6大类: 胶原酶、明胶酶、基质溶解酶、膜型金属蛋白酶、细胞溶解素及其他MMPs类。其中，MMP-1是一种胶原酶，由成纤维细胞、吞噬细胞、内皮细胞和上皮细胞等合成和分泌，可降解细胞外基质中最为丰富的蛋白即胶原，如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖的核心蛋白等；MMP-2是一种明胶酶，由成纤维细胞、多形核中性粒细胞、巨噬细胞等产生，主要降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原、明胶、纤维连结蛋白、蛋白多糖、弹性蛋白[9-10]。鉴于MMP-1和MMP-2均可由成纤维细胞合成和分泌，且在细胞外基质的降解中发挥重要作用，因此，本实验选择MMP-1和MMP-2为检测指标。

有学者认为DIGO的发生与药物浓度密切相关，牙周的局部药物浓度可能决定了药物对牙龈成纤维细胞的作用。有研究[11]表明牙龈增生患者龈沟液中的药物浓度远高于血药浓度，因此本研究选择1μg/ml的药物浓度用于实验研究，较接近药物的局部浓度。本实验发现: 在硝苯地平作用下，MMP-1 mRNA的表达量24h时无明显变化,而48h时明显减少(P<0.05)；MMP-2 mRNA的表达量也明显减少(P<0.05)，表明硝苯地平可能通过减少MMP-1和MMP-2基因的表达，使胶原降解减少，而参与细胞外基质的堆积。已有的研究也表明硝苯地平可减少MMPs的分泌。Maita等[12]将硝苯地平与正常牙龈成纤维细胞共同培养后发现，10μmol/L浓度的硝苯地平可以明显降低MMP-1蛋白的表达量。

许多研究[13-14]表明，菌斑引起的炎症与DIGO的发生以及严重程度有关。LPS作为革兰阴性菌的主要毒力因子，可以激活多种靶细胞而参与各种炎症介质及细胞因子的产生,而可能会改变细胞对药物产生的应答。本实验模拟炎症状态下硝苯地平的作用情况，将硝苯地平与LPS共同作用于牙龈成纤维细胞，发现: 与对照组相比，MMP-1 mRNA的表达量明显增加，且24h时更加显著(P<0.05)，MMP-2表达无明显变化。说明炎症因子可参与调节MMPs的表达，一定程度上逆转硝苯地平对MMPs表达的抑制作用，但具体机制有待进一步研究。

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Effects of nifedipine on expression of matrix metalloproteinase-1 and matrix metalloproteinase-2 in human gingival fibroblasts

CHENLong-jie1，2,YANGJun1，2,LIWu-li1，2,ZHAOShou-liang1,3

(1. Dept. of Endodontics, Stomatology Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China;2. Laboratory of Oral Biomedical Science and Translational Medicine, Tongji University, Shanghai 200072, China；3. Dept. of Stomatology, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China)

Objective To investigate the effects of nifedipine on the expression of matrix metalloproteinase-1(MMP-1) and matrix metalloproteinase-2(MMP-2) in human gingival fibroblasts (GFs)invitro. Methods The gingival tissue specimens obtained from periodontal surgery were culturedinvitro. GFs were identified by immunocytochemistry. The expression levels ofMMP-1 andMMP-2 mRNA in GFs were detected by quantitative Real-Time PCR after cells stimulated by nifedipine(1μg/ml), LPS (1μg/ml) and nifedipine (1μg/ml)+LPS(1μg/ml). Results GFs culturedinvitroshowed vimentin positive and keratin negative signal. The mRNA expression ofMMP-1 andMMP-2 were significantly down-regulated after 48h treatment of nifedipine. The mRNA expression ofMMP-1 was significantly up-regulated after GFs were treated with nifedipine+LPS, whereas there were no significant changes inMMP-2 expression. Conclusion These results suggest that nifedipine may be involved in proliferation of gingival fibroblasts through inhibition ofMMP-1 andMMP-2 expression.

gingival fibroblasts; nifedipine; lipopolysaccharide;matrix metalloproteinase

10.16118/j.1008-0392.2015.04.007

2015-04-08

国家自然科学基金(81170951)；上海市科委员医学引导项目(10411964600)

陈龙杰(1988—)，女，硕士研究生.E-mail： dentistclj@126.com

赵守亮.E-mail： slzhao@tongji.edu.cn

R 78

A

1008-0392(2015)04-0033-05