miR-182在三阴性乳腺癌中的表达及意义

于金玲， 沈卫达， 龚 波， 徐锦屏， 高蓓敏， 赵海燕

(上海市长宁区妇幼保健院乳腺科，上海 200051)



·基础研究·

miR-182在三阴性乳腺癌中的表达及意义

于金玲， 沈卫达， 龚 波， 徐锦屏， 高蓓敏， 赵海燕

(上海市长宁区妇幼保健院乳腺科，上海 200051)

目的 探讨miR-182在三阴性乳腺癌中的表达及意义。方法 收集30例石蜡包埋的三阴性乳腺癌患者的癌组织和癌旁组织标本,并收集患者的基本资料。RT-PCR测定miR-182的相对表达，分析miR-182在TNBC中的表达与肿瘤的大小、分级、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、无疾病生存率、总生存率等的相关性。结果 RT-PCR结果提示，癌组织中miR-182表达为癌旁组织的8.6倍，差异有统计学意义(P<0.001)。miR-182在淋巴结阳性及TNM分期Ⅲ期中表达高于淋巴结阴性(Z=-3.454,P=0.001)及TNM(Ⅰ+Ⅱ)期者(Z=-3.946,P=0.000)，差异有统计学意义；COX回归多因素分析显示，miR-182高表达(HR=0.107，95%CI: 0.018～0.643，P=0.015)、淋巴结阳性(HR=0.189，95%CI: 0.020～1.757，P=0.016)、脉管瘤栓(HR=0.190，95%CI: 0.020～1.826，P=0.008)、Ki67≥14%(HR=0.182，95%CI: 0.041～0.801，P=0.024)、TNM分期(Ⅲ期)(HR=0.501，95%CI: 0.044～5.741，P=0.001)是独立的预后因子。结论miR-182在三阴性乳腺癌中表达上调,与淋巴结转移及临床分期相关，miR-182高表达是三阴性乳腺癌独立的预后因素之一，与预后差相关。

三阴性乳腺肿瘤；miR-182； 预后； 侵袭

三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)是雌激素受体、孕激素受体和表皮生长因子受体-2表达均阴性的一类乳腺癌，恶性程度高，预后差，超过5年生存期的患者不到30%。研究表明[1]，TNBC并不是单一的疾病，而是在分子、病理学和临床水平上异质性的疾病，不同的组织学亚型具有不同的生物学行为。近年发现某些特异性miRNA在乳腺癌中表达上调或下调，但目前关于miRNAs与TNBC临床病理及预后之间的相关性研究并不多见。本研究选择三阴性乳腺癌为研究对象，研究miR-182表达与三阴性乳腺癌临床病理参数及预后的关系，探讨其作为临床侵袭性及预后判断标准的潜在价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2009年1月至2013年1月在上海市长宁区妇幼保健院行乳腺癌改良根治的三阴性乳腺癌患者共30例，入选病例均有完整临床随访资料，术前未接受过放疗及化疗，全部标本经组织病理学证实，术后辅助化疗采用TAC方案(吡柔比星+环磷酰胺+多西他赛)，腋窝淋巴结转移≥3个或肿瘤大小≥5cm者予以胸壁+锁骨上区放疗。患者发病年龄为31～73岁，中位发病年龄为51.1岁。

1.2 主要试剂和仪器

石蜡组织总RNA提取试剂盒(Recover-ALLTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit)购自美国ABI公司；RT反转录试剂盒、SYBR-Green Ⅰ荧光试剂盒购自丹麦Exiqon公司；hsa-miR-182引物、内参U6由丹麦Exiqon公司合成。酶标仪(DU-600型分光度计)购自Beckman公司产品，Real Time PCR仪(ABI 7500)购自美国Ambion公司产品。

1.3 方法

1.3.1 蜡块组织中提取RNA 将石蜡包埋的组织切成≥20μm的薄片，取≤80μm的石蜡组织，常规脱蜡，蛋白酶消化，按照蜡块组织提取试剂盒说明书进行，离心柱洗脱出总RNA。检测RNA溶液吸光值D260、D280，计算RNA浓度和纯度，D260、D280比值介于1.8～2.1方可用于cDNA合成。2%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性，RNA存于-80℃备用。

1.3.2 cDNA合成 所有模板RNA浓度调至110mg/L，5×Reaction buffer 4μl+Enzyme mix 2μl+Nuclease-free water 10μl+模板总RNA 4μl共20μl体系，反应条件为: 42℃ 60min，95℃ 5min。

1.3.3 Real-Time PCR 以第一链cDNA为模板应用特定加尾结构的引物进行，Real-Time PCR扩增，hsa-miR-182结构为如下。 GSP: 5′-GGCTTTG-GCAATGGTAGAAC-3′,R: 5′-GTGCGTGTCGT-GGAGTCG-3′(GSP是对应miRNA的特异引物，R是与RT引物相匹配的引物)。PCR扩增体系为: cDNA 8μl，SYBR Green master mix 10μl，PCR mix 2μl；反应条件: 50℃ 2min，95℃ 10min，预变性；95℃变性15s，60℃退火1min；72℃延伸30s，40个循环。

1.3.4 CT值计算 记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的阈值时所经历的循环数即CT值，以U6作为内参照，采用定量PCR中的相对定量法。数据采用2-ΔΔCT法进行分析。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1miR-182表达水平与三阴性乳腺癌临床病理指标的关系

全部病理切片均经组织学证实。复发患者为手术后随访中发生局部复发和(或)远处转移的患者。RT-PCR结果提示癌组织中miR-182表达水平明显高于癌旁正常组织(9.01±5.11vs1.06±0.46，t=-8.41，P=0.000)。经MannWhitney-U非参数检验，三阴性乳腺癌中淋巴结阳性者miR-182表达水平明显高于淋巴结阴性者(Z=-3.454，P=0.001)；TNM分期Ⅲ期中表达高于TNM(Ⅰ+Ⅱ)期者(Z=-3.946,P=0.000)，有脉管瘤栓的高于无脉管瘤栓者，差异有统计学意义(Z=-3.247,P=0.001)。在随访中复发的三阴性乳腺癌中，miR-182表达水平显著高于无复发转移的三阴性乳腺癌(Z=-2.408，P=0.016)；同时未发现其与组织学分级、肿瘤大小、是否基底样癌、月经状态、ki67指数之间存在显著相关性(P>0.05)，见表1。

2.2 Cox回归多因素分析结果

miR-182高表达(HR=0.107，95%CI: 0.018～0.643，P=0.015)、淋巴结阳性(HR=0.189，95%CI: 0.020～1.757，P=0.016)、脉管瘤栓(HR=0.190，95%CI: 0.020～1.826，P=0.008)、Ki67≥14%(HR=0.182，95%CI: 0.041～0.801，P=0.024)、TNM分期(Ⅲ期)(HR=0.501，95%CI: 0.044～5.741，P=0.001)是影响总生存的独立预后因子，见表2。

表1 miR-182表达水平与三阴性乳腺癌临床病理指标的关系Tab.1 Correlations between miR-182 expression and clinicopathological parameters in TNBC

表2 三阴性乳腺癌临床病理指标多因素生存分析Tab.2 Cox proportional hazards regression analysis in TNBC

2.3miR-182表达与三阴性乳腺癌预后的关系

以中位数2-ΔΔCt=7.37作为截断值，Kaplan-Meier生存分析表明，miR-182高表达组无复发生存率明显降低(X2=4.084，P=0.043)，见图1。

图1 miR-182表达水平与三阴性乳腺癌生存率的关系Fig.1 Correlations between miR-182 expression and overall survival in TNBC patients

3 讨 论

miRNAs是具有约22个核苷酸的单链非编码RNA，通过促进靶基因mRNA的降解或抑制翻译而调节靶基因的功能，在细胞的增殖、发育、分化、代谢、凋亡、衰老和肿瘤的发生等多种生物学过程中发挥重要作用。特异性miRNA的差异表达与某些肿瘤的复发转移密切相关，是肿瘤侵袭转移的潜在预测指标。

三阴性乳腺癌侵袭性强、复发早、预后差、远处转移率高，缺乏内分泌及抗HER-2治疗靶点，是乳腺癌治疗的难点。目前，关于miR-182与TNBC的研究并不很多。Liu等[2]报道了miR-182促进TNBC细胞的增殖和迁移，抑制其凋亡等；Lei等[3]研究表明，miR-182的高表达与乳腺癌的复发和远处转移相关。本研究结果显示，miR-182在TNBC中表达上调；进一步分析发现，miR-182在淋巴结阳性及TNM分期Ⅲ期中表达高于淋巴结阴性及TNM分期(Ⅰ+Ⅱ)患者(P<0.001)；多因素回归分析表明，miR-182高表达与淋巴结转移、脉管瘤栓、ki-67指数是三阴性乳腺癌独立的预后因素。有研究[3]表明，miR-182在乳腺癌细胞中上调、活化RhoA蛋白，促进乳腺癌的侵入和转移。乳腺癌细胞中，miR-182通过β-catenin信号通路上调，抑制RECK而增加致瘤性和侵入性。miR-182的表达在TNBC组织和细胞中显著增加，促进TNBC细胞的增殖和迁移，抑制其凋亡等[4]。本研究结果进一步印证了上述结论，提示miR-182很可能参与TNBC的发生发展，其高表达与TNBC侵袭及转移有关。近年来发现多种miRNAs与TNBC的预后相关。Toyama等[5]研究表明，miR-210的高表达与TNBC无疾病生存率和总生存率呈负相关。Svoboda等[6]表明，miR-34b的高表达与TNBC无疾病生存和总生存负相关。Kaplan-Meier生存分析表明，miR-182高表达组无复发生存率明显降低(P<0.05)，与TNBC预后不良有关。由于三阴性乳腺癌预后的影响因素是多方面的，miR-182作为潜在的预后因子还需要仔细评估。

[1] Dreyer G, Vandorpe T, Smeets A, et al. 2013. Triple negative breast cancer: clinical characteristics in the different histological subtypes[J]. Breast, 2013,22(5): 761-766.

[2] Liu H, Wang Y, Li X, et al. Expression and regulatory function of miRNA-182 in triple-negative breast cancer cells through its targeting of profilin 1[J]. Tumour Biol, 2013,34(3): 1713-1722.

[3] Lei R, Tang J, Zhuang X, et al. 2014. Suppression of MIM by microRNA-182 activates RhoA and promotes breast cancer metastasis[J]. Oncogene,33(10): 1287-1296.

[4] Chiang CH, Hou MF, Hung WC. Up-regulation of miR-182 by beta-catenin in breast cancer increases tumorigenicity and invasiveness by targeting the matrix metalloproteinase inhibitor RECK[J]. Biochim Biophys Acta, 2013,1830(4): 3067-3076.

[5] Toyama T, Kondo N, Endo Y, et al. High expression of microRNA-210 is an independent factor indicating a poor prognosis in Japanese triple-negative breast cancer patients[J]. Jpn J Clin Oncol, 2012,42(4): 256-263.

[6] Svoboda M, Sana J, Redova M, et al. MiR-34b is associated with clinical outcome in triple-negative breast cancer patients[J]. Diagn Pathol, 2012,7: 31.

Expression of microRNA-182 in triple-negative breast cancer and its clinicopathological significance

YUJin-ling，SHENWei-da，GONGBo，XUJin-ping,GAOBei-min，ZHAOHai-yan

(Dept. of Breast Surgery， Changning District Maternal and Infant Health Hospital， Shanghai 200051, China)

Objective To investigate the expression of microRNA-182(miR-182) in triple-negative breast cancer(TNBC) and its clinicopathological significance. Methods Thirty patients with triple-negative breast cancer underwent mastectomy, and the surgical specimens were collected. Quantitative Real-Time polymerase chain reaction(RT-PCR) was used to detect the expression ofmiR-182 in cancer tissues and pericancerous tissue. And the relationship betweenmiR-182 expression in TNBC cancer tissues and clinicopathological characteristics, including tumor size, grade, lymph node metastasis, distant metastases, TNM staging, disease-free survival, distant metastasis-free survival, overall survival were analyzed. Results RT-PCR results indicated that the expression ofmiR-182 in cancer tissue was 8.6 times higher as that in pericancerous tissue (P<0.001). In cases of lymph node positive and TNM stage Ⅲ, the expression ofmiR-182 was higher than those of lymph node negative(Z=-3.454,P=0.001) and TNM stage(Ⅰ+Ⅱ)(Z=-3.946,P=0.000)．Cox proportional hazards risk analysis indicated that the high expression ofmiR-182(HR=0.107,95%CI: 0.018-0.643,P=0.015), positive lymph nodes(HR=0.189,95%CI: 0.020-1.757,P=0.016), lymphovascular invasion(HR=0.190,95%CI: 0.020-1.826,P=0.008), Ki67≥14%(HR=0.182,95%CI: 0.041-0.801,P=0.024), TNM staging Ⅲ(HR=0.501,95%CI: 0.044-5.741,P=0.001) were the independent prognostic factors for TNBC. Conclusion The expression ofmiR-182 is up-regulated in TNBC, which is correlated with positive regional lymph nodes metastasis and advanced TNM stage. The high expression ofmiR-182 is one of the independent prognostic factors of TNBC, associated with poor prognosis.

triple negative breast cancer；miR-182； prognosis； invasion

10.16118/j.1008-0392.2015.04.006

2015-02-23

于金玲(1976—)，女，主治医师，硕士.E-mail： yjl152152@163.com

R 737.9

A

1008-0392(2015)04-0029-04