针刺百会、足三里穴对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织及血清miRNA-29、miRNA-320 表达的影响*

张亚敏，徐 虹，孙 华，陈素辉，王富明，杨 杨

(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院，北京100730)

microRNA 是一类广泛存在于动物、植物、病毒进化过程中，高度保守，长度约为18 ～24 个核苷酸的单链非编码的RNA 分子，通过mRNA 剪切和抑制蛋白翻译方式负调控靶基因，广泛参与生物体的生长、发育、凋亡等生理病理过程［1-2］。研究表明，血浆和血清中稳定存在的miRNA 可能是某些疾病诊断的生物标识分子［3］，而特定的miRNA 参与了缺血性脑血管病脑损伤及损伤修复过程，对缺血性脑卒中相关的特定miRNA 进行深入研究，将为本病提供一种新的诊断策略和治疗相关生物标识分子［1-2］。课题前期研究［4-5］发现针刺大鼠百会、足三里穴能明显改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能缺损，并可能通过调节细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)中的基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMPS)及水通道蛋白(Aquaporin，AQPs)实现，miRNA-29 可能是调节ECM稳态的一个节点，miRNA-320 可上调脑缺血模型大鼠中AQP1 及AQP4 基因及蛋白的表达［6-8］。据此笔者假设电针百会和足三里穴对脑缺血再灌注损伤大鼠的MMPs/AQPs 的表达是否能通过microRNA 途径调节实现，进一步探讨针刺百会、足三里穴对脑缺血再灌注损伤大鼠保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与器材

健康雄性SPF 级SD 大鼠(230 ～270 g)，许可证号:SCXK(京)2012-0001。实验过程中对动物的操作符合北京协和医院实验动物研究指南。器材包括:2636-4A 线栓(北京沙东生物技术公司)，水合氯醛(国药集团化学试剂北京有限公司)，紫外分光光度计UV-2000(尤尼柯上海仪器有限公司)，超纯RNA 提取试剂盒(美国Omega R6812)，DNase set(美国Omega E1091)，cDNA 第一链合成试剂盒(美国Promega M5301)，荧光定量PCR 检测系统(美国伯乐CFX96)。

1.2 动物模型制备与纳入标准

大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型制作参考Longa 等［9］的线栓法。10%的水合氯醛(0.35 ml/100 g)麻醉大鼠。消毒后切开颈正中皮肤，暴漏右侧颈总动脉，颈内动脉和颈外动脉。在颈外动脉剪口，插入线栓，使线栓沿颈内动脉缓慢插入，以闭阻右侧MCA 入口，2 h 后拔出线栓实现再灌注，大鼠清醒后以Bederson 评分法［10］对大鼠神经功能进行评分(1 ～3 分纳入)。

1.3 实验分组与处理

SD 大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组和药物组。后3 组先制作MCAO 模型，然后根据再灌注时间又分为1 天、3 天、5 天和7 天组。假手术组:除不插线栓外和模型组相同;模型组:造模成功后每日常规抓取1 次;电针组:造模成功后，根据李忠仁主编的《实验针灸学》［11］中的大鼠常用针灸穴位定位法分别取百会穴(顶骨正中处)和左侧足三里穴(膝关节后外侧、腓骨小头下约5 mm 处)，以一次性无菌针灸针刺入穴位，针柄接脉冲治疗仪，疏密波、频率2 Hz、强度约2 mA，以肌肉收缩为度，日1 次，每次20 min;药物组:造模成功后腹腔注射依达拉奉(南京先声东元制药有限公司，H20031342)3 mg/kg，日1 次。

1.4 脑组织及血清标本的制备

实验大鼠按照规定时间点，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血后并于室温下静置2 h，置于离心机中离心(3500 rpm)20 min，分离血清，存于-80℃冰箱中。取血于冰上分离缺血区脑组织置于冻存管内，液氮冻存。

1.5 脑组织及血清microRNA 提取与检测

应用超纯RNA 提取试剂盒(美国Omega R6812)提取脑组织及血清样本中的miRNA，实时荧光定量PCR 法检测脑组织和血清中的miRNA-29、miRNA-320 的表达。miRNA-29 的上游引物:GGCTAG CAC CAT TTG AAA T，下游通用引物:GTGCAGGGTCCGAGGT;miRNA- 320 的上游引物:GGCAAA AGC TGG GUU GAG A，下游通用引物:GTGCAGGGTCCGAGGT;以GADPH 作为内参。通过公式2-ΔΔCT计算法得到各样品的目的基因相对定量结果。

1.6 统计学处理

数据录入和处理均采用SPSS17.0 统计软件包，所有数据采用均数±标准差(¯x ±s)描述，采用One Sample Kolmoglrov-Smirnov Z test 检验数据是否符合正态分布，符合正态分布的多组独立样本比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，非正态分布数据采用非参数检验方法(K Independent Samples Test)。各种检验的显著性水平均设定为P ＜0.05。

2 结果

2.1 各组各时间点大鼠脑组织miRNA-29 的表达变化比较

脑缺血再灌注损伤1 天到7 天时间内，miRNA-29 表达在模型组、电针组和药物组呈先升高后降低趋势，再灌注3 天时达到峰值，同期各个时间点，电针组和药物组大鼠脑组织miRNA-29 表达均显著低于模型组(P ＜0.05)，电针组与药物组都能下调脑组织中miRNA-29 表达;同期各个时间点，电针组和药物组大鼠脑组织miRNA-29 表达差异具有统计学意义(P ＜0.05)，电针对miRNA-29 下调作用弱于药物。见表1。

表1 各组各时间点大鼠脑组织miRNA-29 的表达变化

2.2 各组各时间点大鼠血清miRNA-29 的表达变化比较

血清中miRNA-29 表达与脑组织中趋势一致;同期各个时间点，与模型组相比，电针组和药物组血清中miRNA-29 表达显著降低，差异具有统计学意义(P ＜0.05);与药物组相比，电针组血清miRNA-29 表达在1 天、3 天及5 天时间点显著升高，差异具有显著性(P ＜0.05)，但在7 天时间点，电针组和药物组表达差异无显著性。见表2。

表2 各组各时间点大鼠血清miRNA-29c 的表达变化(±s)

表2 各组各时间点大鼠血清miRNA-29c 的表达变化(±s)

注:与假手术组比较，△P ＜0.05;与模型组比较，☆P ＜0.05;与电针组比较，* P ＜0.05;与药物组比较，OP ＜0.05。

组别 n 1 天 3 天 5 天 7天假手术组 3 1.00±0.00☆＊O 1.00±0.00☆＊O 1.00±0.00☆＊O1.00±0.00☆＊O模型组 3 2.46±0.13△＊O 2.71±0.15△＊O 2.53±0.10△＊O1.76±0.30△＊O电针组 3 1.90±0.07△☆O 2.06±0.09△☆O 2.01±0.06△☆O1.42±0.05△☆药物组 3 1.21±0.05△☆＊1.39±0.10△☆＊1.23±0.04△☆＊1.27±0.03△☆

2.3 各组各时间点大鼠脑组织miRNA-320 的表达变化比较

脑缺血再灌注损伤1 天到7 天，miRNA-320 的表达在模型组、电针组和药物组呈先降低后升高趋势，再灌注3 天时为最低点;与模型组相比，同期各个时间点大鼠脑组织miRNA-320 表达在电针组和药物组均显著升高(P ＜0.05)，电针组与药物组都能上调miRNA-320 表达;与药物组相比，同一时间点电针组miRNA-320 表达显著低于药物组(P ＜0.05)，电针组作用弱于药物组。见表3。

表3 各组各时间点大鼠脑缺血区miRNA-320的表达变化(±s)

表3 各组各时间点大鼠脑缺血区miRNA-320的表达变化(±s)

注:与假手术组比较，△P ＜0.05;与模型组比较，☆P ＜0.05;与电针组比较，* P ＜0.05;与药物组比较，OP ＜0.05。

组别 n 1 天 3 天 5 天 7天假手术组 3 1.00±0.00☆＊O 1.00±0.00☆＊O 1.00±0.00☆＊O1.00±0.00☆＊O模型组 3 0.50±0.01△＊O 0.30±0.01△＊O 0.52±0.01△＊O0.50±0.01△＊O电针组 3 0.74±0.07△☆O 0.48±0.02△☆O 0.69±0.01△☆O0.71±0.01△☆O药物组 3 0.82±0.02△☆＊0.62±0.01△☆＊0.81±0.01△☆＊0.81±0.01△☆＊

2.4 各组各时间点大鼠血清miRNA-320 的表达变化

血清miRNA-320 表达与脑组织中趋势一致;同期各个时间点，电针组和药物组大鼠血清miRNA-320 表达高于同期的模型组(P ＜0.05)，电针组与药物组都能上调miRNA-320 表达;与药物组相比，电针组miRNA-320 表达低于同一时间点药物组(P ＜0.05)，与调控脑组织miRNA-320 的表达变化趋势一致。见表4。

表4 各组各时间点大鼠血清miRNA-320 的表达变化(±s)

表4 各组各时间点大鼠血清miRNA-320 的表达变化(±s)

注:与假手术组比较，△P ＜0.05;与模型组比较，☆P ＜0.05;与电针组比较，* P ＜0.05;与药物组比较，OP ＜0.05。

组别 n 1 天 3 天 5 天 7天假手术组 3 1.00±0.00☆＊O 1.00±0.00☆＊O 1.00±0.00☆＊O1.00±0.00☆＊O模型组 3 0.49±0.03△＊O 0.36±0.03△＊O 0.51±0.02△＊O0.44±0.11△＊O电针组 3 0.79±0.05△☆O 0.54±0.04△☆O 0.65±0.02△☆O0.80±0.04△☆O药物组 3 0.88±0.04△☆＊0.70±0.08△☆＊0.73±0.02△☆＊0.91±0.01△☆＊

3 讨论

缺血性脑血管病约占脑卒中总数的80%，死亡率和致残率均较高，造成了严重的社会负担［12］。探索缺血性脑血管病的发病机制，并采取安全有效的干预措施来降低缺血性脑血管病引起脑组织损伤，已成为亟待解决的难题。本病属中医中风范畴，病机为阴阳失调、气血逆乱。根据针灸经络理论，百会穴总督一身之阳，位于头部巅顶，“头者神之居”为“精明之府”，具有开窍醒神之功。“病变在脑，首取督脉”为治疗脑缺血疾病的首选，且百会穴为手足三阳、督脉、足厥阴之会，内系于脑，可通督醒神。足三里穴为足阳明经要穴，阳明经多气多血，又“主润宗筋”，宗筋约束骨骼，利于关节运动，对中风之“肢体痿痹不用”尤为适宜。脑缺血后机体正气不足，属于积损正衰，百会和足三里穴两穴同用具有补中益气、调节阴阳之效，研究显示其对缺血性脑血管病的良好调节作用［13-14］。

miRNAs 家族通过与特定mRNA 的3'端非翻译区(3'-Untranslated Regions，3'UTR)的不完全或完全互补结合，进而抑制靶mRNA 翻译成蛋白质或促使其降解。最近的研究表明脑缺血后大量的基因被诱导或抑制，可能与miRNA 介导的mRNA 的降解和翻译负调控作用相关。脑出血和脑水肿形成的主要原因是血脑屏障(Blood Brain Barrier，BBB)的开放，造成脑组织的继发性损伤。BBB 是脑组织与周围环境进行物质交换的通道，对脑组织内环境稳态的维持起着重要作用［15］。近年来，研究发现脑缺血再灌注后诸多因子参与了后续的BBB 破坏。MMPs 可降解和重塑包括紧密连接蛋白、基膜蛋白等的细胞外基质，和BBB 完整性密切相关［16-17］，AQPs 是一组具有高选择性的水孔道特异蛋白家族，分布于脑部的主要为AQP4。AQP4是胶质细胞与细胞间液、脑脊液以及血管之间的水调节和交换的重要结构基础，参与了脑缺血再灌注后BBB 破坏，脑水肿的形成［18-19］。miRNA-29 家族调节包括富含半胱氨酸的分泌蛋白、层粘连蛋白、胶原I及胶原IV、MMPs 等，是调节ECM 稳态的一个节点［6-7］。研究显示miRNA-29 在人和大鼠的脑缺血后上调，可能通过调控ECM 参与了脑缺血后血脑屏障的破坏［20］，Sepramaniam 等［8］报道抗miRNA-320 可上调MCAO 模型大鼠中AQP1 及AQP4 基因及蛋白的表达。miRNA-320 能与编码AQP4 蛋白的mRNA 结合，导致其翻译停滞或降解，负调控AQP4 蛋白表达。

本实验研究选定的阳性对照药为依达拉奉，可清除自由基，抑制脂质过氧化，从而抑制脑细胞、血管内皮细胞及神经细胞的氧化损伤，减轻脑缺血后和脑缺血引起的水肿及组织损伤，并缓解损伤后伴随的神经症状［21-22］。本研究发现针刺大鼠百会、足三里穴能下调miRNA-29 的表达。电针能抑制细胞外基质破坏的miRNA-29 在脑组织及血清中的表达，从而多途径减少ECM 降解，且电针组大鼠脑组织及血清miRNA-320 表达较模型组显著升高，可能通过此途径下调了AQP4 蛋白的表达，减轻脑水肿程度，保护缺血后脑组织。药物组对miRNA-29、miRNA-320 的调控作用优于同时期的电针组。

本研究结果表明针刺大鼠百会、足三里穴能下调脑缺血大鼠脑组织及血清miRNA-29 的表达，上调miRNA-320 表达，减轻缺血再灌注后脑损伤，针刺对脑缺血再灌注后脑组织有一定的保护作用，但具体保护作用机制与依达拉奉的作用机制尚待研究。针刺及药物在防治脑缺血再灌注损伤的实验研究虽然已取得了一定的成效，为临床防治脑缺血性疾病奠定了一定的理论基础。然而脑缺血再灌注损伤的机制相当复杂，是多种因素共同作用的结果，因此，多机制、多药物联合运用的综合性研究有待进一步开展，可从整体、分子和基因水平等不同角度对其作用机制进行深入研究，将针刺与药物联合应用，采用中西医结合疗法开展基础与临床研究，为临床防治脑缺血性疾病提供科学依据，是今后研究的重要方向。

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