火针对脊髓损伤模型大鼠神经功能缺损恢复程度和脊髓神经超微结构的影响*

王剑歌，李岩，周震，陆军，刘保红，蔡志敏，程素利，周智梁

(1.天津中医药大学，天津300193;2.天津市公安医院，天津300042;3.天津中医药大学第二附属医院，天津300150)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种常导致患者残疾或死亡的损伤性疾病，给无数家庭带来极大痛苦。因此对于脊髓损伤的恢复，尤其是组织结构及运动神经功能恢复的研究逐渐成为大家关注的热点与难点。本研究通过建立急性SCI 模型大鼠，在不同时段运用Basso-Beattic-Bresnahan 行为功能评分(BBB运动评分)［1］，采用透射电镜进行超微结构观察，观察火针疗法对SCI 模型大鼠神经功能缺损恢复程度和脊髓神经超微结构的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

健康SD 雄鼠，重约260 ～300 g。由中国食品药品检定研究所提供(许可证号:SCXK(京)2009-0017);标准条件统一喂养。天津实验动物中心饲养、观测、造模、取材。

1.2 实验仪器

HITACHI H-7500 透射电子显微镜(Electron Microsope)(日本制造);超薄切片机LKB-III

1.3 实验试剂

20 g/L 戊巴比妥钠;2.5%戊二醛;二甲砷酸钠缓冲液;1%锇酸;酒精。

2 实验方法

2.1 动物分组

本实验通过随机对照盲法，将大鼠分为火针治疗组、脊髓损伤对照组、空白组和假手术组，其中火针治疗组和脊髓损伤对照组每组又分为1 天、3 天、7 天、10天、14 天5 个时间段，每个时间段各10 只。

2.2 模型制备

采用改良的Allen's 法制备急性SCI 动物模型［2］，术后饲养大鼠谨防感染，每天常规挤压膀胱排尿3 次，直到反射性膀胱排空形成。

2.3 治疗方法

本实验穴位选取参考《动物针灸穴位图谱》及《实验针灸学》。具体穴位为T7、T8、T11、T12棘突下两侧的华佗夹脊穴。

火针针刺方法:穴位常规消毒后，左手持酒精灯，右手持火针。加热针体至通红后向选好的穴位速刺，每穴刺一针，共8 穴，深度为3 ～5 mm。

2.4 电镜标本提取

大鼠处死后于冰上取大鼠损伤部位脊髓，投入4℃2.5%戊二醛固定液中固定2 h;二甲砷酸钠缓冲液冲洗;1%锇酸4℃固定2 h;ddH2O 冲洗;梯度酒精脱水;环氧丙烷置换;Epon812 包埋;包埋块修整;取1 μm半薄切片，天青-美兰染色，光学显微镜定位;醋酸双氧铀、枸橼酸铅染色，透射电镜观察。

2.5 运动功能评分

在各评分时间点将大鼠排空膀胱后对其进行BBB 评分。首先将动物置于2 m2的光滑平地，使其自主运动5 min，然后参照评分标准评分。满分为21 分，共分3 项。第一项为0 ～7 分，对大鼠下肢各个关节活动进行评判;第二项为8 ～13 分，评判下肢的步态及是否协调;第三项为14 ～21 分，评判爪的精细动作。运动功能越好则得分越高。

2.6 统计学处理

采用SPSS18.0 统计软件包对所得数据进行统计学处理，数据以均数±标准差(±s)表示，检验方法为非参数检验，P ＜0.05 表示差异具有显著性意义。

3 实验结果

3.1 BBB 评分结果

大鼠BBB 评分见表1。从术后3 天开始，火针治疗组与脊髓损伤对照组评分结果均逐渐升高，并持续到术后14 天，但火针治疗组评分均高于脊髓损伤对照组。

表1 大鼠各个时间段运动神经功能BBB 评分比较

3.2 电镜观察

假手术组与空白组的有髓神经纤维髓鞘排列规则，板层致密，髓索结构正常，与髓鞘之间无间隙。内容物线粒体、微丝、微管数量正常。神经元细胞结构清晰完整，含有高尔基复合体、滑面内质网、线粒体、尼氏体、神经原纤维和溶酶体等结构。细胞核大而圆，核膜完整，核染色质颗粒细致，分布均匀。

脊髓损伤对照组显示大量有髓神经髓鞘分层水肿，髓索明显缩小，线粒体、微丝、微管明显减少，见封三图1。

神经元细胞膜局部缺如，细胞质轻度水肿，细胞器数量减少，线粒体部分嵴和少部分膜溶合，模糊不清，嵴有缺失和空化现象，粗面内质网有轻度溶合和脱颗粒现象，游离核糖体数量减少，见封三图2。

火针治疗组显示有髓神经髓鞘分层水肿，髓索明显缩小，线粒体、微丝、微管明显减少，见封三图3。

神经元细胞质轻度水肿，细胞器数量减少，线粒体部分嵴和少部分膜溶合，模糊不清，可见嵴有缺失现象，粗面内质网有轻度溶合和脱颗粒现象，游离核糖体数量减少，核形状比较整齐，核膜、核仁较正常，见封三图4。

4 讨论

研究提示，初级神经元的损失是神经损伤后神经功能障碍的最根本的原因，并且神经元的存活是神经损伤后再生修复的先决条件［3］。在脊髓损伤模型大鼠运动功能评定方面，本实验选择BBB 评分。其特点是包括了SCI 后大鼠后肢恢复过程中所有行为变化，与脊髓损伤的程度相符度高，且评分者在评分时主观因素少［4］。

火针疗法，古代称为“焠刺”，不同于毫针的特点是需要将针体加热烧红后，再进行针刺。《灵枢·官针》云:“焠刺者，刺燔针则取痹也。”脊髓损伤属于中医“痿证”、“痹症”。脊髓损伤后临床症状多是因为督脉不通、气滞血瘀。火针可以行气活血、温通经脉，在临床应用中对于多种疾病具有显著疗效，尤其是痹证［5］。华佗夹脊穴与督脉相连，针刺可以直达病所，同时避免了直接刺激督脉腧穴出现损失脊髓的可能性。因此，火针针刺华佗夹脊穴安全、有效，一定程度上减轻了脊髓损伤的临床症状。现代研究发现火针能够促进脊髓损伤大鼠脑源性神经营养因子阳性神经元的表达和运动神经元功能的恢复［6］，且火针干预的血清能够诱导内源性神经干细胞增殖分化［7］。

本研究结果提示，脊髓损伤后的神经功能学评分与电镜下脊髓的组织结构变化具有相关一致性。火针治疗后大鼠功能恢复程度与脊髓损伤对照组相比有显著性差异，电镜下火针治疗组大鼠脊髓损伤部位可见神经元胞核和神经纤维修复再生，表明火针可以促进脊髓损伤大鼠神经功能恢复。

［1］ Scheff SW，Saucier DA，Cain ME. A statistical method for analyzing rating scale data:the BBB locomotor score［J］.J Neurotrauma，2002，19(10):1251-1260

［2］ 孙立明，李岩，周震，等.火针对脊髓损伤模型大鼠凋亡相关蛋白表达的影响［J］.针灸临床杂志，2010，26(12):49-53

［3］ Fu S Y，Gordon T.The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration［J］.Molecular neurobiology，1997，14(1-2):67-116

［4］ 王民，王栋琪，宋焕瑾.脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复不同评分标准的比较［J］. 西安交通大学学报(医学版)，2006，27(3):243-245

［5］ 李岩，周震，贺普仁，等.火针治疗痹症的疗效观察［J］.中国针灸，2003，23(7):408-411

［6］ 李岩，程素利，周震，等. 火针对大鼠脊髓损伤后运动功能及BDNF 表达的影响［J］.天津中医药，2012，29(9):545-547

［7］ 李岩，周震，程素利，等.火针干预脊髓损伤大鼠血清对神经干细胞增殖分化的影响［J］.天津中医药，2013，30(1):25-27