粗糙钛表面纳米掺锶羟基磷灰石涂层对BMSCs成骨分化的影响

杨华伟, 陈 凯, 尚光伟, 林茂翰, 徐远志, 汪饶饶

(同济大学附属第十人民医院口腔科,上海 200072 )



·基础研究·

粗糙钛表面纳米掺锶羟基磷灰石涂层对BMSCs成骨分化的影响

杨华伟, 陈 凯, 尚光伟, 林茂翰, 徐远志, 汪饶饶

(同济大学附属第十人民医院口腔科,上海 200072 )

目的 研究粗糙钛表面纳米掺锶羟基磷灰石涂层对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)增殖、成骨分化的影响。方法 采用电化学沉积技术在粗糙钛表面沉积薄层纳米掺锶羟基磷灰石、纳米羟基磷灰石，用场发射扫描电子显微镜观察其表征，分析锶元素修饰的纳米羟基磷灰石涂层对大鼠BMSCs增殖、碱性磷酸酶活性、矿化结节形成和成骨相关蛋白骨钙素分泌的影响。结果 纳米掺锶羟基磷灰石涂层和纳米羟基磷灰石涂层不影响细胞增殖，与目前临床广泛应用的金属钛种植体粗糙表面一样具有良好的生物相容性。相较于纳米羟基磷灰石涂层和粗糙组，纳米掺锶羟基磷灰石涂层可增强BMSCs碱性磷酸酶活性，促进矿化结节形成，提高细胞骨钙素的分泌。纳米羟基磷灰石涂层亦表现了比粗糙组更好的生物活性。结论 应用电化学沉积技术进行纳米掺锶羟基磷灰石涂层的制备，可以促进BMSCs成骨分化、种植体周围新骨早期形成，提高种植体骨组织结合率。

钛； 锶； 羟基磷灰石； 骨髓间充质干细胞

口腔种植义齿是近年来迅速发展起来的一种新型口腔修复体，其有效的支持和良好的咀嚼功能逐渐被越来越多的失牙患者所接受，但目前临床患者仍需忍受较长的愈合时间。羟磷灰石中的锶元素，不仅可以促进体外成骨细胞的增殖和胶原蛋白的合成，抑制破骨细胞的分化和功能[1-2]，而且可以促进体内骨形成，抑制骨吸收，改善骨的微细结构[3-5]。因此，将锶元素组装在钛种植体表面，可改善种植体表面生物学性能，促进种植体早期骨整合。

近年来，采用电化学沉积技术整合微量元素于纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite, HA)涂层相关研究未见报道。本研究采用电化学沉积方法，在粗糙钛表面沉积薄层纳米掺锶羟基磷灰石(strontium-substituted nano-hydroxyapatite, Sr-HA)、HA，分析微量元素锶对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)增殖和成骨分化的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

茜素红S、β-甘油磷酸钠、地塞米松、抗坏血酸、细胞裂解液购自美国Sigma公司；低糖DMEM培养基、胰蛋白酶、青霉素/链霉素、磷酸盐缓冲液购自美国HyClone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；ALP测定试剂盒购自日本Wako公司；Alamar Blue细胞活性试剂盒购自美国Invitrogen公司；大鼠骨钙素ELISA试剂盒购自美国Biomedical Technologies公司；抗大鼠CD29、CD90、CD11b/c、CD45单克隆抗体购自英国Abcam公司；场发射扫描电子显微镜购自荷兰FEI公司；流式细胞检测仪购自美国BD公司；酶标仪购自瑞士TECAN公司；CO2培养箱购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 实验方法

1.2.1 粗糙钛片表面的制备(喷砂酸蚀法)[6]直径为10、30mm的两种钛片依次用碳化硅砂纸打磨、喷砂，再经丙酮、75%乙醇、蒸馏水依次超声清洗15min后，烘干。加入氢氟酸与硝酸混合液(蒸馏水、0.11mol/L氢氟酸、0.09mol/L硝酸的体积比为1000∶2∶4)常温处理10min，冲洗、超声清洗、烘干后，加入盐酸与硫酸混合酸(蒸馏水、5.8mol/L盐酸、8.96mol/L硫酸的体积比为2∶1∶1)80℃处理30min，最后经冲洗、超声清洗、N2吹干，放置于干净玻璃培养皿中备用。

1.2.8 血清骨钙素(osteocalcin, OC)含量测定和钙结节染色 取第4代大鼠BMSCs，以1×105/孔接种至6孔板钛片上，24h后更换成成骨诱导培养基。在第7、14天时收集细胞培养基，-80℃保存，等所有样品收集完毕，用大鼠OC ELISA试剂盒检测细胞分泌在培养基中的OC含量。测得的OC含量用总蛋白含量标准化。诱导28d后，PBS冲洗2遍，用4%多聚甲醛固定5min，最后用茜素红S染色液染色1h，PBS冲洗后拍照。

2.5 不同钛片表面对大鼠BMSCs矿化结节形成的影响

2.6 不同钛片表面对大鼠BMSCs OC分泌的影响

1.2.5 大鼠BMSCs表面标志鉴定 取对数期生长状态良好的第4代BMSCs，PBS冲洗2次，常规消化、离心、弃上清液，加预冷PBS重悬细胞。重复清洗2次后，加PBS制成约1×107/ml的单细胞悬液，各取100μl悬液于流式管中，避光依次加入FITC荧光标记的抗体CD29、D90、CD11b/c、CD45，同时做空白对照。4℃孵育30min，用流式细胞仪检测表面标志物的表达。

1.2.6 Alamar Blue法检测BMSCs增殖 收集对数期第4代大鼠BMSCs，接种于24孔板钛片上，每块钛片表面接种的细胞量约为1×104个。在无钛片的标准孔中依次接种0、0.625×104、1.25×104、2.5×104、5×104、1×105个细胞，每孔中培养基补充至500μl，待细胞基本黏附后每孔加入50μl Alamar Blue细胞活性试剂，37℃避光孵育4h。用荧光酶标仪(激发波长540～570nm，发射波长580～610nm)读荧光密度值，做出标准曲线。接种1、3、7d，对钛片上的细胞行Alamar Blue法检测，吸弃培养基，每孔加入500μl等量培养基，再加入50μl Alamar Blue细胞活性试剂，37℃孵育4h后用荧光酶标仪读荧光密度值，并根据标准曲线计算对应的细胞量。

中国古人有立德、立功与立言的“三不朽”之说。德指道德，是说一个人的修养与人格；功指事功，说的是人要建功立业；言指思想，就是说一个人是靠他的思想或学术而扬名。

1.2.7 碱性磷酸酶活性测定 取第4代大鼠BMSCs，接种至6孔板钛片上，每块钛片表面接种的细胞量约为1×105个。在第7、14天时将细胞板取出，吸弃培养基，PBS冲洗钛片2遍，在每块钛片上滴加细胞裂解液200μl，4℃裂解细胞15min，收集裂解液，-80℃保存。待所有样本收集完毕，按照试剂盒说明来检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的活性。并用总蛋白含量对ALP活性进行标准化处理。

1.2.2 粗燥钛片表面纳米(掺锶)羟基磷灰石涂层的制备(电化学沉积法)[6]配制Sr-HA涂层电解液： 氯化钙 1.2×10-3mol/L，磷酸二氢胺 7.2×10-4mol/L，氯化锶 1.33×10-4mol/L，氯化钠0.1mol/L。配制HA涂层电解液： 氯化钙1.2×10-3mol/L，磷酸二氢胺7.2×10-4mol/L，氯化钠0.1mol/L。粗糙钛片浸没在上述电解液后，在 85℃，直流电压3V下，经电化学工作站沉积 30min，电解液的(掺锶)羟基磷灰石结晶在钛片表面，形成一层与金属钛结合的(掺锶)羟基磷灰石薄层。再经清洗、干燥、双面紫外照射2h后备用。

四是以宣传培训为抓手营造良好社会氛围。组织部门应把人大制度理论纳入领导干部特别是镇街党（工）委书记教育培训的重要内容，通过邀请人大专家授课、开展民主法治教育等形式，提高镇街党（工）委书记对人大工作重要性的认识，提高强化其把党委决策与人大依法行使职权相结合的意识；宣传部门和新闻单位应把宣传人大工作列入年度工作计划，开展常态化、有针对性的宣传，及时报道人大工作中涌现出的好典型、好经验，提高全社会对人大工作的认知度。人大常委会应重点抓好镇街人大干部和代表的学习培训，通过举办学习班、交流研讨会等，使其深刻理解人大工作的性质和特点，熟悉掌握履职的程序和方法。

2 结 果

2.1 钛片FSEM下表面形貌

各组钛片扫描电镜结果见图1。经喷砂酸蚀后，对照组钛片表面布满孔隙，直径为10～30μm，且孔隙表面充满更微小的孔隙，直径为0.5～3.0μm。而采用电化学法在粗糙钛表面制备的HA涂层，厚度为6～7μm，呈棒状，横断面直径为70～80nm，且Sr-HA薄层的棒状直径较HA组小。

图1 各组钛片在扫描电镜下的表面形貌Fig.1 FSEM micrograph of the roughened surface, HA-coating surface and Sr-HA-coating surface

2.2 细胞表面标志鉴定

流式细胞仪检测结果显示，第4代大鼠BMSCs免疫表型CD29、CD90、CD45、CD11b，阳性率分别为100%、98.0%、0.1%、0.2%，见图2。

图2 大鼠BMSCs表面标志的表达Fig.2 The expressions of surface antigens on rat BMSCs

2.3 不同钛片表面对大鼠BMSCs增殖的影响

随着培养时间的延长，不同钛片表面的细胞数出现明显的增长，但各组间差异均无统计学意义(图3)。表明纳米掺锶羟基磷灰石涂层和纳米羟基磷灰石涂层对BMSCs没有毒性，且对其活性和增殖无明显影响，与目前临床广泛应用的金属钛种植体粗糙表面一样，具有良好的生物相容性。

（二）用时政材料激发学生思考。例5：在复习《政府权力的行使和监督》一课时，例举国家欲在各地区设立国家监察委员会这一机构，普及了该机构的性质、职能，并设问：“国家为什么要成立此机构？说明什么问题？你是支持还是反对，又是为什么？”学生讨论热烈，纷纷表达自己的观点，这样就把所学的知识很自然的运用于解读社会热点了。

图3 不同钛片表面对大鼠BMSCs增殖的影响Fig.3 Effects of different coatings on rat BMSCs proliferation

2.4 不同钛片表面对大鼠BMSCs ALP活性的影响

从读者角度来看，一个经营成功的阅读推广品牌不仅包含可以提供让其有所收获的一系列活动，还有足以让读者参与的价值感，即品牌可以成为一种质量承诺，还可以是一种心理感受和情感依托，在这种情况下，品牌对图书馆来说已经是一项有生命力的资产了，即品牌资产。

不同钛片表面成骨诱导28d后，染色的BMSCs外观见图5。Sr-HA组和HA组的钙化面积明显大于粗糙组，说明纳米(掺锶)羟基磷灰石涂层可明显促进BMSCs矿化结节的形成。

图4 不同钛片表面对大鼠BMSCs ALP活性的影响Fig.4 Effect of different coatings on cell alkaline phosphatase activity of rat BMSCs#P<0.05，★P<0.05

1.2.3 钛片表面涂层表面形貌观测 用场发射扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscope, FSEM)观察分析上述钛片表面的形貌。

林地除草未进行彻底清除，致使杂草丛生；在整形修剪方面，未及时进行幼树的整形修剪，或修剪不达标，枝条横生、丛生，导致一些幼树透气性较差，影响正常生长。

BMSCs ALP活性随时间延长而升高(图4)。第7、14天，Sr-HA组、HA组的ALP活性明显高于粗糙组(P<0.05)，且Sr-HA组亦显著高于HA组(P<0.05)。

1.2.4 大鼠BMSCs分离和培养 将新生SD大鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡5min后，无菌条件下取出胫骨、股骨，放入含PBS的培养皿中，剔除附着的软组织和和末端软骨后，放入含低糖DMEM培养基的培养皿中,再用剪刀从中间剪断长骨，用无菌5ml注射器针头抽吸培养基反复冲洗骨髓腔，至骨头呈苍白色。细胞冲洗液在5%CO2、37℃条件下于原塑料培养皿培养。48h后换液，之后每2～3d更换培养基，并在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况。当细胞在培养皿中贴壁生长接近80%平铺时，吸弃原培养基，用PBS冲洗2次，以0.25%胰蛋白酶消化细胞，再加入培养基终止消化，并用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，传代。

1.3 统计学处理

我先不知道对你称呼什么好些?一个青年可以在他敬爱的姑娘前面叫名字么?我想,你有少年人底理性和勇敢,你还是做我底弟弟罢。

第7天，Sr-HA组培养基中OC含量明显高于HA组和粗糙组(P<0.05)；第14天，Sr-HA组和HA组培养基中OC含量显著高于粗糙组(P<0.05)，说明纳米(掺锶)羟基磷灰石涂层可促进BMSCs OC分泌，见图6。

3.1.3 坝料摊铺 粘土心墙料铺筑沿坝轴线进行，铺料时严格控制铺土厚度，土料采用推土机及装载机摊铺平整，并随时进行铺料厚度测量，确保厚度满足要求。

图5 不同钛片表面对大鼠BMSCs矿化结节形成的影响Fig.5 Effect of different coatings on mineralized nodules formation of rat BMSCs

图6 不同钛片表面对大鼠BMSCs细胞外OC分泌的影响Fig.6 Effect of different coatings on extracellular osteocalcin secretion of rat BMSCs#P<0.05，★P<0.05

3 讨 论

钛基种植体表面改性的方法有很多种。本研究运用电化学沉积技术在粗糙纯钛表面成功地制备出纳米级掺杂锶元素的羟基磷灰石涂层。与传统的钛浆喷涂等技术相比较，此技术简单有效，价格低廉，能够在纳米尺度级别控制涂层的厚度。制备出的涂层结构有序、均一，具有完整的三维结构和良好的机械性能。

目前，临床上常用的种植体表面处理为喷砂酸蚀，这种技术极大地增加了种植体的表面积，促进种植体周围的骨整合。本研究采用喷砂酸蚀表面为对照组，结果表明： BMSCs在不同钛片表面的增值结果均无显著性差异，说明Sr-HA、HA与目前临床广泛应用的金属钛种植体喷砂酸蚀表面一样，对细胞无明显毒性，具有良好的生物相容性。

ALP是骨形成所必需的酶，是评价成骨细胞早期的分化指标。ALP的表达随着成骨细胞分化的发展而增强，其通过催化水解有机磷释放磷酸根离子和自由的羟基来促进羟基磷灰石形成。OC是成骨细胞合成并分泌的一种含有γ羧基谷氨酸的非胶原蛋白，是反映成骨细胞分化的晚期指标。OC具有调节骨代谢的功能，在维持骨正常矿化，抑制软骨钙化以及不规则晶体沉积中有重要的作用。细胞基质中钙盐沉积的变化直接反映细胞成骨分化的程度，而茜素红染色是用于检测细胞基质中钙盐沉积的一种常用且较特异的方法。本研究显示，通过电化学沉积技术在粗燥钛片表面制备的纳米掺锶羟基磷灰石涂层显著促进大鼠BMSCs分化和细胞外基质的矿化。相较于纳米羟基磷灰石涂层和粗糙组，纳米掺锶羟基磷灰石涂层可显著增强BMSCs ALP活性，促进OC分泌和矿化结节形成，与Capuccini等[7]的研究结果一致。原因可能是： 羟基磷灰石是人体骨骼和牙齿的矿物质主要成分，也是细胞外基质的重要成分，具有良好的生物相容性；本研究采用电化学沉积技术制备的HA涂层，较好地模拟了细胞外基质的三维结构，促进了BMSCs及成骨前体细胞向成骨细胞的分化。但是，此HA纯度高，结晶度高，因而吸收降解较慢，影响了骨整合后期新骨的沉积。当HA涂层掺入锶元素后，羟磷灰石结构发生改变，与人体中天然HA组成更接近。此时羟磷灰石结晶度增大，溶解性增加，局部Ca2+浓度升高，促进新骨形成[8]。目前，微量元素锶的作用机制仍不清楚。Saidak等[9]认为微量元素锶通过激活Wnt和ERK1/2-MAPK信号通路，增加Runx2，减少PPARγ2表达，促进BMSCs向成骨方向分化，还通过激活钙敏感受体促进成骨细胞的增殖和成骨分化，抑制破骨细胞的分化和功能，从而增加成骨。

授课时需要向学生讲授各软件层的功能与特点，通过实例讲解让学生认识到操作系统并不是嵌入式软件体系中的必需层次，引导学生根据嵌入式系统的软件体系结构对软件设计分层和分块。重视嵌入式汇编语言的教学内容，强调汇编语言在执行效率和时序性方面具有不可取代的优势。在驱动程序编写教学内容方面，通过一些驱动小例程，让学生建立起通过“软件”控制“硬件”的概念，如在课堂上给学生演示通过对GPIO相关寄存器进行配置并控制I/O口点亮、熄灭LED的例程。必要的情况下，根据学情加入一些先导课程如数字逻辑、51单片机的复习内容，帮助学生理解嵌入式驱动程序与硬件的关联性。

综上所述，应用电化学沉积技术制备的纳米掺锶羟基磷灰石涂层，可以促进BMSCs成骨分化，若用于种植体表面改性，有望进一步促进种植体周围新骨早期形成和提高种植体骨组织结合率。但微量元素如何作用于BMSCs，其具体的分子机制还有待进一步的研究。

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[9] Saidak Z, Marie PJ. Strontium signaling： Molecular mechanisms and therapeutic implications in osteoporosis[J]. Pharmacol Ther, 2012,136(2)： 216-226.

Osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells on strontium-substituted nano-hydroxyapatite coated roughened titanium surface

YANGHua-wei,CHENKai,SHANGGuang-wei,LINMao-han,XUYuan-zhi,WANGRao-rao

(Dept. of Stomatology, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China)

Objective To investigate osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on strontium-substituted nano-hydroxyapatite (Sr-HA) coated roughened titanium surface. Methods Sr-HA coating and HA coating were fabricated on roughened titanium surfaces by electrochemical deposition technique and characterized by field emission scanning electron microscope (FESM). BMSCs were cultured on Sr-HA coating, HA coating and roughened titanium surfaces respectively. Cell proliferation, alkaline phosphatase (ALP) activity, mineralized nodules formation and cell osteocalcin (OC) secretion were measured. Results Electrochemically deposited Sr-HA coating and HA coating titanium surface had no effect on the proliferation of BMSCs and had good biocompatibility. BMSCs cultured on Sr-HA coating surface showed increased alkaline phosphatase activity, mineralized nodules formation, and cell osteocalcin secretion compared with the other two groups. Cells cultured on HA coating surface also showed increased biological activity compared with the roughened surface. Conclusion Sr-HA coated titanium surfaces by electrochemical deposition can promote osteogenesis of BMSCsinvitroand have the potential to shorten bone healing period and enhance implant osseointegration.

titanium; strontium; hydroxyapatite; bone marrow mesenchymal stem cells

10.16118/j.1008-0392.2015.01.004

2014-09-09

上海市青年医师资助项目(20120318)

杨华伟(1980—)，男，主治医师，学士.E-mail： yanghuawei2002@hotmail.com

汪饶饶.E-mail： raoraowang@hotmail.com

R 783

A

1008-0392(2015)01-0013-05