屋尘螨提取液在BALB/c小鼠气道炎症中的作用

赵 敏, 范秋淋, 孙奋勇, 陈春球, 李 智

(1. 同济大学附属第十人民医院检验科，上海 200072； 2. 苏州大学医学部，江苏 苏州 215000； 3. 同济大学附属第十人民医院胃肠外科，上海 200072； 4. 上海市杨浦区中心医院检验科，上海 200090)



·基础研究·

屋尘螨提取液在BALB/c小鼠气道炎症中的作用

赵 敏1, 范秋淋2, 孙奋勇1, 陈春球3, 李 智4

(1. 同济大学附属第十人民医院检验科，上海 200072； 2. 苏州大学医学部，江苏 苏州 215000； 3. 同济大学附属第十人民医院胃肠外科，上海 200072； 4. 上海市杨浦区中心医院检验科，上海 200090)

目的 比较3种屋尘螨提取液(house dust mite extract, HDM)对BALB/c小鼠气道炎症表型的影响，并分析其可能的原因。方法 BALB/c小鼠于实验第0、7、14、21、28、35天进行PBS液或HDM液(100μg/50μl PBS)滴鼻。采用头体积描记法测量小鼠的气道反应性；对支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BAL)进行细胞计数和分类；ELISA法检测BAL中CXCL1、CXCL2、CCL11(eotaxin)、IL-5、IFN-γ、IL-10和IL-17的含量及血清总IgE；对肺组织PAS染色后进行病理学观察。结果 HDM1诱导了以中性粒细胞和嗜酸性粒细胞为主的混合型气道炎症；HDM2诱导的小鼠气道炎症以中性粒细胞升高为主；HDM3仅诱导了微弱的小鼠气道炎症反应，未见中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的显著增加。3种HDM均引起BAL中CXCL1蛋白水平的升高，并伴随着高脚杯细胞增生等病理组织学改变。结论 不同来源的HDM可能与不同类型的小鼠气道炎症相关。

屋尘螨提取液； 气道炎症； 支气管肺泡灌洗液

house dust mite extract; airway inflammation; bronchoalveolar lavage fluid

屋尘螨提取液(house dust mite extract, HDM)是目前常用来构建小鼠哮喘模型的致敏原，它由蛋白质和肽等不同成分组成，并具有蛋白酶、结合蛋白等多种生物学功能，其中Der p(Dermatophagoidespteronyssinus)1和Der p 2被认为是最主要的致敏原[1]。由于Der p在不同的HDM中含量不尽相同，如Der p 1在HDM1(Allergopharma公司)中的含量为4.5%，在HDM2(Greer实验室)中的含量仅为1.4%，Der p 2亦如此。因而，不同来源的HDM可能对小鼠具有不同的致敏作用。本研究比较了3种不同来源的HDM(HDM1、HDM2、HDM3)对BALB/c小鼠气道炎症表型的影响，并分析其可能的原因。

1 材料与方法

1.1 实验动物

野生型雌性BALB/c小鼠，6～8周龄，体质量(20±2)g，购于德国Harlan Winkelmann中心，所有小鼠均在无致病菌环境下饲养。

1.2 主要试剂与仪器

HDM1、HDM2或HDM3情况见表1。小鼠CXCL1、CXCL2、CCL11(eotaxin)、IL-17试剂盒购自美国R&D Systems公司；小鼠IL-5、IFN-γ、IL-10抗体及IgE ELISA试剂盒购自美国BD Pharmingen公司；CASY®TT细胞计数仪购自德国Schärfe System公司；Sunrise酶标仪购自德国Tecan公司；Cytocentrifuge Cytospin 3离心机购自英国Shandon公司；Centrifuge Megafuge 1.0R离心机购自德国Heraeus公司；Olympus显微镜购自日本Olympus公司。

表1 HDM数据表

1.3 动物分组及处理

BALB/c小鼠20只，随机分为4组： PBS阴性对照组(PBS)、HDM1组、HDM2组、HDM3组，每组5只。于实验第0、7、14、21、28、35天，各组小鼠接受50μl PBS液或HDM液(100μg/50μl PBS)滴鼻。实验第36天，测量小鼠的气道反应性(airway reactivity, AR)。实验第37天，将小鼠处死后采集标本进行检测。

1.4 气道反应性测量

采用头体积描记法测量小鼠的气道反应性。结果记录为Mch 50(mg/ml)，表示引起呼气中段流量基线水平(baseline midexpiratory airflow)下降50%的乙酰甲胆碱浓度。

1.5 BAL细胞分类计数及细胞因子检测

小鼠经氯胺酮麻醉后，仰卧固定，剪开气管，气管针插管，注入1ml预冷的含蛋白酶抑制剂的PBS液，进行支气管肺泡灌洗，灌洗3次。4℃，离心半径10cm，1200r/min,离心10min，收集上清液获得BAL，-80℃保存。用含1% BSA的PBS液1ml重悬，使用CASY®TT 细胞计数仪测量细胞总数后，取50μl重悬液作1∶200稀释，经Cytocentrifuge Cytospin 3离心制备细胞涂片，吉姆萨染色，镜下分类计数。采用ELISA法检测BAL中趋化因子和细胞因子CXCL1、CXCL2、CCL11(eotaxin)、IL-5、IFN-γ、IL-10和IL-17的含量，操作按说明书进行。

1.6 血清总IgE检测

经小鼠腋静脉采集静脉血0.8ml，于室温下静置1h后。4℃，离心半径10cm，2000r/min,离心10min，留取血清。采用ELISA法检测血清总IgE，操作按说明书进行。

1.7 肺组织病理学观察

结扎支气管，切取左肺组织，置6%福尔马林液固定过夜，石蜡包埋后连续5μm切片，PAS染色。镜下观察肺组织病理学变化，使用CAST系统计算高脚杯细胞的百分比和黏液分泌物的含量，操作按说明书进行。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 不同HDM致敏原引起的气道炎症反应

鼻滴HDM1、HDM2或HDM3引起小鼠气道不同程度的白细胞募集。与PBS组比较，HDM1组小鼠气道可见白细胞的大量浸润(P<0.05)，主要由中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的增多引起；HDM2组小鼠气道可见白细胞和中性粒细胞的数目显著增加(P<0.01)，嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的数目未发生明显改变；HDM3组小鼠气道仅发生微弱的炎症反应。3种HDM致敏原均未引起小鼠气道反应性的显著改变(图1)。

图1 3种HDM致敏原在小鼠模型中引起的气道炎症和气道反应性Fig.1 Airway inflammation and airway reactivity induced by 3 different HDM in a mouse model注： *P<0.05, **P<0.01

2.2 BAL液中CXCL1的蛋白水平变化

与PBS组比较，HDM1、HDM2和HDM3组BAL液中CXCL1的蛋白水平显著升高(P<0.01)，3组间差异无统计学意义(图2)。各组小鼠中CXCL2、CCL11、IFN-γ、IL-5、IL-10和IL-17的含量均低于检测下限。

2.3 HDM致敏原未引起血清总IgE含量的改变

小鼠经HDM1、HDM2或HDM3致敏后，血清总IgE含量变化无统计学意义(P>0.05)，见图3。

2.4 肺组织中高脚杯细胞和黏液分泌的变化

经PAS染色后，PBS组小鼠肺组织切片未见明显病理改变，各级支气管及肺泡结构规则且完整，小支气管及血管周围无炎性细胞浸润，支气管管壁黏膜完整无断裂及脱落。HDM1、HDM2和HDM3组肺组织切片小支气管及血管周围均见明显的炎性细胞浸润，支气管上皮细胞部分断裂及脱落(图4)。与PBS组比较，HDM组高脚杯细胞增生显著增多(P<0.05)，3组间差异无统计学意义(图5)。

图2 小鼠BAL中CXCL1的蛋白水平Fig.2 Protein level of CXCL1 in BAL注： *P<0.01

图3 小鼠血清中总IgE的蛋白含量Fig.3 Protein content of IgE in serum

图4 肺组织病理学检测结果Fig.4 Pathological results in lung tissues

图5 小鼠肺组织中高脚杯细胞和黏液分泌物的含量Fig.5 Contents of goblet cells and mucin in lung tissuesA： 高脚杯细胞；B： 黏液内容物；*P<0.05

3 讨 论

HDM是与人类哮喘发生密切相关的一类过敏原，它广泛存在于日常生活中，如尘埃、地毯、被褥、床垫、枕芯等。它不同于卵清蛋白，可直接通过呼吸道引起人类哮喘的发生，且不需要佐剂(如Alum)的辅助，因而备受科学家的关注并得到了较多的研究[2]。但由于在不同的实验中，受HDM的来源与提取方法、注射途径与剂量、致敏模式等因素的影响，HDM在动物模型中的致敏效果及其与气道炎症表型间的关系目前尚未形成定论。研究[3]表明，鼻滴100μg HDM(与50μg HDM相比)对小鼠气道炎症具有更强的诱导作用。本研究比较了由3种不同来源的HDM构建的小鼠气道炎症模型的特点，发现来自Allergopharma公司的HDM1诱导了以中性粒细胞和嗜酸性粒细胞为主的混合型气道炎症；来自Greer实验室的HDM2诱导的小鼠气道炎症以中性粒细胞升高为主；同样来自Greer实验室的HDM3仅诱导了微弱的小鼠气道炎症反应，未见中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的显著增加。3种HDM均引起BAL中CXCL1蛋白水平的升高，并伴随着高脚杯细胞增生等病理组织学改变。

由HDM1、HDM2和HDM3所诱导的炎症表型间的差异可能归结为其致敏原成分(如Der p 1)含量的不同。Post等[4]的研究表明，HDM组分对于上皮细胞重构和气道炎症起着关键性作用。但有关HDM对小鼠气道炎症诱导机制的研究目前仍面临着较多困难，一方面由于HDM提取方法的不同及其组分的复杂性，使得各组分的具体功能难以确定。另一方面则由于它的多变性，来源于同一公司的HDM可能因为批号的不同而具备不同的活性(如本研究中的HDM2和HDM3)。Herman等[5]的体外试验显示，Der p 1具有蛋白酶的作用，它通过裂解半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶等酶原物质而发挥活性。而De Alba等[6]的研究结果则表明，HDM中蛋白酶活性的丧失并未影响其诱导炎症反应，提示可能存在其他诱导机制。由于不同来源HDM间的固有差异，构建小鼠气道炎症模型已成为研究HDM的有效方式，并将用于指导哮喘等慢性呼吸道疾病[7]的诊断和治疗。

综上所述，本研究通过对小鼠气道炎症模型的构建，发现不同来源的HDM可能与不同类型的气道炎症相关，这可以为进一步开展以HDM为基础的分子疫苗治疗方法提供一些线索。

[1] Stevenson CS, Birrell MA. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance[J]. Pharmacol Ther, 2011,130(2)： 93-105.

[2] Hagner S, Harb H, Zhao M, et al. Farm-derived Gram-positive bacterium Staphylococcus sciuri W620 prevents asthma phenotype in HDM-and OVA-exposed mice[J]. Allergy, 2013,68(3)： 322-329.

[3] 赵敏,李智,于永春.屋尘螨在诱导BALB/c小鼠混合型气道炎症中的作用及致病机制探讨[J].国际免疫学杂志,2013,36(4)： 319-324.

[4] Post S, Nawijn MC, Hackett TL, et al. The composition of house dust mite is critical for mucosal barrier dysfunction and allergic sensitization[J]. Thorax, 2012,67(6)： 488-495.

[5] Herman J, Thelen N, Smargiasso N, et al. Der p 1 is the primary activator of Der p 3, Der p 6 and Der p 9 the proteolytic allergens produced by the house dust mite Dermatophagoides pteronyssinus[J]. Biochim Biophys Acta, 2014,1840(3)： 1117-1124.

[6] De Alba J, Raemdonck K, Dekkak A, et al. House dust mite induces direct airway inflammationinvivo： implications for future disease therapy？[J]. Eur Respir J, 2010,35(6)： 1377-1387.

[7] 黄漾,邱志宏,魏为利,等.咳嗽敏感性和咳嗽变异性哮喘的比较研究[J].同济大学学报： 医学版,2011,32(1)： 68-72.

Effect of house dust mite extracts on airway inflammation in BALB/c mice

ZHAOMin1,FANQiu-lin2,SUNFen-yong1,CHENChun-qiu3,LIZhi4

(1. Dept. of Clinical Laboratory, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China; 2. Medical College of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; 3. Dept. of Gastrointestinal Surgery, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China; 4. Dept. of Clinical Laboratory, Central Hospital of Yangpu District, Shanghai 200090, China)

Objective To investigate the effect of house dust mite extracts (HDM) on airway inflammation in a murine model. Methods BALB/c mice received an intranasal instillation of PBS or 3 different HDMs (100μg) on the 0, 7th, 14th, 21th, 28th, 35th days. After the final challenge, airway responsiveness (AR), histological changes in the airways and immunological status were examined. Results HDM1 induced the most robust influx of both neutrophils and eosinophils into the airways, HDM2 exerted a stronger effect on the induction of neutrophil airway inflammation, while HDM3 only elicited a very weak inflammatory response. Conclusion Different origins of HDM might contribute to different phenotypes of murine airway inflammation.

10.16118/j.1008-0392.2015.01.001

2014-06-11

国家自然科学基金(81170345)

赵 敏(1978—)，女，主管技师，博士.E-mail： zmin78@163.com

李 智.E-mail： lizhishi2001@163.com

R 562.1

A

1008-0392(2015)01-0001-04