蒙成药黄柏八味散质量标准研究

李占海

(内蒙古自治区人民医院，内蒙古 呼和浩特 010017)

黄柏八味散，蒙药名为沙日毛都-8，由黄柏、香墨、栀子、甘草、红花、荜茇、牛胆粉、黑云香八味药材组成，具有清热解毒作用，用于炽热，血热，脏腑之热，肺热咳嗽，痰中带血，肝火肋痛［1］。红花是黄柏8 味散的主要成分之一，具有扩血管、降血压、降血脂、抗凝血、抗炎和提高抗缺氧能力等作用。羟基红花黄色素A 是红花的主要化学成分。黄柏八味散是《中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册》(1998 年版)收载品种，原标准中没有收载相关定性定量指标，故参照文献［2-11］采用高效液相色谱法对黄柏八味散中红花进行含量测定，可为该药质量标准的提高提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器: 大连依利特P230 型高效液相色谱仪;色谱柱: 依利特Hypersil ODS2(5μm，4.6mm×250mm);KQ5200E 型超声仪(功率200W，频率40KHz);电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司，0.0001g)。

1.2 试剂与药品: 盐酸小檗碱对照品(批号: 110713 -

201212)，栀子苷对照品(批号: 110749 -201316)，胡椒碱对照品(批号: 110775 -201104)，羟基红花黄色素A 对照品(批号: 111637 -201106)均购自中国食品药品检定研究院。黄柏八味散(呼和浩特市中蒙医院，批号: 130615、130910、140421);甲醇为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 黄柏的薄层鉴别: 取本品粉末0.4g，加1%醋酸甲醇溶液20mL，超声处理20min，滤过，滤液浓缩至2mL，作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品0.1g，缺黄柏阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成对照品溶液和阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010 年版一部附录VIB)试验，分别吸取上述3 种溶液各10μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(30: 10: 4)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。紫外灯(365nm)下检视。结果显示: 供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性色谱无干扰。结果见图1。

2.1.2 栀子的薄层鉴别: 取本品粉末0.67g，加乙醇溶液10mL，超声处理40min，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取栀子苷对照品g，缺栀子阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成栀子苷对照品溶液和阴样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010 年版一部附录VIB)试验，分别吸取上述3 种溶液各5μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5: 5: 1: 1)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液，在110 加热条件下显色。结果显示: 供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红褐色斑点，且阴性色谱无干扰。结果见图2 。

2.1.3 荜茇的薄层鉴别: 取本品粉末0.4g，加无水乙醇溶液10 mL，超声处理30min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取胡椒碱0.2g，缺荜茇阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成对照品溶液和阴性样品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010 年版一部附录VIB)试验，分别吸取上述3 种溶液各10μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮(7;2: 1)为展开剂，展开，取出，晾干。至紫外灯(365nm)下检视。结果显示: 供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的蓝色荧光斑点，且阴性色谱无干扰。结果见图3。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件: 色谱柱: 依利特Hypersil ODS2(5μm，4.6mm × 250mm);流动相: 甲醇-0.5%乙酸溶液(20: 80);检测波长: 403nm;流速: 1.0mL·min-1;柱温: 25℃。理论板数按羟基红花黄色素A 计算应不低于3000。

2.2.2 溶液的制备: 对照品溶液的制备: 精密称取羟基红花黄色素A 对照品5.00mg，置100mL 棕色容量瓶中，加入25%甲醇溶解，定容，制成50μg·mL-1的溶液，作为储备液。取对照品储备液15mL 于50mL 棕色容量瓶中，加入25%甲醇稀释至刻度，制成15μg·mL-1的溶液，即得对照品溶液。

供试品溶液的制备: 取黄柏八味散约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇溶液50mL，称定重量，超声处理40min，放冷，称定重量，加25%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液，即得。

阴性样品溶液的制备: 按黄柏八味散处方称取除红花外的其余药材，按照制备供试品溶液的方法制备阴性样品溶液。

2.2.3 专属性试验: 分别吸取供试品溶液、对照品溶液及阴性样品溶液各20μL，按“2.1”色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，羟基红花黄色素A 与其他组分色谱峰可基线分离，分离度符合规定，且阴性样品无干扰。色谱图见图4。

2.2.4 线性范围: 精密吸取羟基红花黄色素A 对照品溶液(50.00μg·mL-1)0.2、0.5、1.0、3.0、5.0、8.0mL，分别置于10mL 棕色容量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别配制成1、2.5、5、15、25、40μg·mL-1的溶液。按照上述色谱条件，分别吸取20μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以浓度C(μg·mL-1)为横坐标，峰面积A 为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为: A=23290C-9400.2，r=0.9997。结果显示，羟基红花黄色素A 在1μg·mL-1～40μg·mL-1浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验: 分别精密吸取供试品溶液(呼和浩特市中蒙医院，批号: 130615)与对照品溶液(15μg·mL-1)各20μL，注入高效液相色谱仪，连续进样6 次，分别测定峰面积。结果对照品溶液的RSD 为1.3%;供试品溶液的RSD为0.9%。结果表明: 该测定方法精密度良好，符合含量测定要求。

2.2.6 稳定性试验: 取供试品(呼和浩特市中蒙医院，批号: 130615)溶液，分别于0，2，4，6，8、10h 进样，测定峰面积，RSD 为1.6%。结果表明: 供试品溶液在10h 内稳定性良好，符合含量测定要求。

2.2.7 重复性试验: 取供试品(呼和浩特市中蒙医院，批号: 130615)约1g，精密称定，共6 份，分别按供试品溶液的制备方法制备溶液，各精密吸取20μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，并计算含量，结果羟基红花黄色素A 平均含量为0.6102mg·g-1，RSD 为1.1%。结果表明: 该测定方法的重复性良好，符合含量测定要求。

2.2.8 回收率试验: 取已知含量供试品粉末(呼和浩特市中蒙医院，批号: 130615)约0.5g，共6 份，精密称定，置于具塞锥形瓶中，每份加入羟基红花黄色素A 对照品一定量。分别按供试品溶液的制备方法制备溶液，各精密吸取20μL，注入高效液相色谱仪，测定含量，计算回收率。结果平均加样回收率为101.0%，RSD 为0.8%。结果表明: 该测定方法的准确度良好，符合含量测定要求。结果见表1。

表1 加样回收试验结果

2.3 供试品含量测定

分别取3 个不同批号的供试品约1g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备溶液，各吸取溶液20μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，计算含量。按照《中国药典》2010 版一部的规定，红花中含羟基红花黄色素A 不得低于1.0%来计算，黄柏八味散含羟基红花黄色素A 应不得低于0.5952mg·g-1。结果见表2。

表2 含量测定结果

3 讨论

3.1 提取时间的选择: 实验对超声提取的时间进行了考察，比较了30min，40min，50min，实验结果显示，超声40min已基本提取完全。故确定提取时间为40min。

3.2 流动相的选择: 通过参考文献，比较了不同的流动相: 甲醇: 0.5%乙酸溶液(20: 80)、甲醇: 0.2%磷酸溶液(27: 73)［7］、甲醇: 乙腈: 0.7%磷酸溶液(26: 2: 72)［8］，结果表明: 用甲醇-0.5%乙酸溶液(20: 80)为流动相保留时间适宜，分离效果好，故采用甲醇-0.5%乙酸溶液(20: 80)为流动相。

3.3 研究展望: 本试验以红花为研究对象进行质量标准研究，为了更加全面的提高该药的质量标准，有待于进一步对其他组分进行综合研究，必要时可对黄柏八味散进行指纹图谱的研究。

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