HPLC法测定麦芽糖铁糖浆中防腐剂的含量

焦旭雯，张雷，陈华Δ

(1.广东省食品药品检验所生检生化室，广东 广州 510180；2.华南理工大学 生物科学与工程学院，广东 广州 510006)



HPLC法测定麦芽糖铁糖浆中防腐剂的含量

焦旭雯1，张雷2，陈华1Δ

(1.广东省食品药品检验所生检生化室，广东 广州 510180；2.华南理工大学 生物科学与工程学院，广东 广州 510006)

目的 建立HPLC法测定麦芽糖铁糖浆中防腐剂的含量。方法 采用Kromasil 100-5 C18柱，以乙腈-醋酸盐缓冲液(40:60)为流动相；检测波长为254 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min。结果 羟苯甲酯在0.62～3.72 μg/mL、羟苯丙酯在0.18～1.07 μg/mL线性关系良好，线性方程分别为Y=228494X-2512.5、Y=203351X-3471.4；平均加样回收率分别为100.9%(RSD=1.5%)、99.6%(RSD=0.5%)。结论 本法简便、快速、准确，可用于麦芽糖铁糖浆中防腐剂的测定。

麦芽糖铁糖浆；羟苯甲酯；羟苯丙酯；含量测定

麦芽糖铁糖浆是由瑞士Vifor Pharma公司研制的一种新型口服补铁剂，其主要成分为麦芽糖铁，此外还加有防腐剂(羟苯甲酯和羟苯丙酯)以及奶油香精等其他辅料。它能有效地提高轻到中度缺铁性贫血患者的血红蛋白(hemoglobin，HB)和血清铁蛋白浓度，用于治疗无贫血铁缺乏和缺铁性贫血[1]，目前已在全球80多个国家上市销售，在我国目前还没有获准上市。糖浆剂内含的营养物质，有利于微生物的滋生与繁殖，防腐剂作为处方中的关键组成部分之一，其正确合理使用与否，直接关系到药品的质量[2]。防腐剂按其性质可分为酸性、中性、季胺盐和有机汞等4类，其中羟苯酯类使用最为广泛。口服含羟苯酯类的药品一般不会产生Ⅳ型迟发型过敏反应，但少数特异质患者仍会出现全身性接触性皮炎症状，表现为全身湿疹样病变。一项随机对照试验把14例对羟苯酯类过敏的患者分成安慰剂组和口服含羟苯酯类胶囊组，结果发现仅2例呈阳性反应[3]。国内未见本品防腐剂含量测定的相关报道，故本文建立测定麦芽糖铁糖浆中羟苯甲酯和羟苯丙酯含量的方法，旨在更好的控制本品质量，保证临床用药安全。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器：Waters Empower 2487/2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Sartorius CPA225D电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)。

1.1.2 药品与试剂：羟苯甲酯钠对照品(批号：100719-200701；含量：98.1%)、羟苯丙酯对照品(批号：100444-201102；含量：99.6%)，均购自中国食品药品检定研究院。乙腈(色谱纯，Honeywell，批号：NBLA1H，含量≥99.99%)；奶油香精(瑞士VIFOR公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件：色谱柱：Kromasil 100-5 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流动相为乙腈-醋酸盐缓冲液(称取醋酸钠三水合物680 mg至1000 mL水中，用醋酸调节pH值至4.4)(40︰60)；检测波长：254 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min；进样量为40 μL。

1.2.2 溶液的制备

① 系统适用性溶液：称取奶油香精约100 mg，置于10 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，量取上述溶液0.8 mL，再分别量取羟苯甲酯钠、羟苯丙酯对照贮备液(见“②”)270 μL、30 μL，置于同一10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得。

② 对照品溶液：分别精密称取羟苯甲酯钠、羟苯丙酯0.01447 g、0.01433 g，分别置50 mL量瓶中，加乙醇溶解并制成每1 mL中约含羟苯甲酯钠0.29 mg和羟苯丙酯0.28 mg的混合溶液，作为羟苯甲酯钠、羟苯丙酯对照贮备液；分别精密量取上述对照贮备液 1 mL、 0.25 mL，置于同一10 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，作为混合对照贮备液。精密量取混合对照贮备液 1 mL， 置于10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得。

③ 供试品溶液：取麦芽糖铁糖浆1 mL，置25 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得。

分别量取系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液 40 μL， 按“1.2.1”项下色谱条件进行测定。

1.2.3 线性试验：精密量取混合对照贮备液适量，分别置不同体积的量瓶中，加流动相稀释至刻度，制成浓度为每mL含0.62、1.24、1.86、2.48、3.72 μg的羟苯甲酯对照品溶液，0.18、0.36、0.54、0.71、1.07 μg的羟苯丙酯对照品溶液，按“1.2.1”项下的色谱条件分别进样，记录色谱图。

1.2.4 精密度试验：取对照品溶液，按“1.2.1”项下的色谱条件连续进样6次，记录色谱图。

1.2.5 稳定性试验：取供试品溶液，按“1.2.1”项下的色谱条件，在10 ℃分别于0、1、4、8、12、24 h进样40 μL，测定峰面积。

1.2.6 重复性试验：取同一批(批号：426001)样品6份，分别按“1.2.2”项下③方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定。

1.2.7 回收率试验：精密量取已知含量的供试品(批号：426001，羟苯甲酯：0.615 mg/mL，羟苯丙酯：0.170 mg/mL)1 mL，置25 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品贮备液；分别取对照品溶液0.3、0.5和0.6 mL，各置10 mL量瓶中，分别加入供试品贮备液0.5 mL，加流动相定容，摇匀，制成60%、100%和120%的低、中、高浓度溶液，每个浓度平行3份。按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率。

1.2.8 样品测定：取3批样品，按照供试品溶液配制方法制备，分别采用按“1.2.1”项下的色谱柱(色谱柱1#)及Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，300 Å)色谱柱(色谱柱2#)，按上述条件进行测定，以峰面积分别计算羟苯甲酯、羟苯丙酯的含量。

2 结果

2.1 系统适用性试验 羟苯甲酯与奶油香精2个色谱峰的分离度分别为5.9、6.9，分离效果较好。见图1。

图1 各溶液HPLC色谱图Fig.1 HPLC Chromatogram of each solution

2.2 线性试验 以各组分浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程：羟苯甲酯：Y=228494X-2512.5，r=1.000(n=5)；羟苯丙酯：Y=203351X-3471.4，r=1.000(n=5)。结果表明，羟苯甲酯在0.62～3.72 μg/mL，羟苯丙酯在0.18～1.07 μg/mL线性关系良好。

2.3 精密度试验 羟苯甲酯及羟苯丙酯峰面积的RSD分别为0.10%及0.22%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验 羟苯甲酯及羟苯丙酯峰面积的RSD分别为0.21%及0.38%，表明该溶液在24 h内稳定。

2.5 重复性试验 测得羟苯甲酯平均含量为0.61 mg/mL，RSD=0.51%；羟苯丙酯平均含量为0.17 mg/mL，RSD=0.62%。

2.6 回收率试验 羟苯甲酯、羟苯丙酯的加样回收率分别为100.89%，RSD值为1.5%、99.59%，RSD值为0.5%。结果表明该方法有良好的回收率。见表1。

表1 回收率计算结果(n=9)

2.7 样品测定结果 采用Kromasil 100-5 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱与Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，300 Å)色谱柱测定结果基本一致。见表2。

表2 样品防腐剂含量测定结果(mg/mL，n=2)Tab.2 Determination and robustness results of preservative in samples (mg/mL，n=2)

3 讨论

3.1 色谱条件选择 本文参考大多数文献[4-9]使用C18色谱柱进行考察，经DAD光谱扫描，确定254 nm为羟苯甲酯和羟苯丙酯的测定波长。由于处方中添加的奶油香精有紫外吸收，且在羟苯甲酯前后各有一色谱峰，其与羟苯甲酯的分离度成为主要考察目标。本文采用的流动相为乙腈-醋酸盐缓冲液(pH4.4)(40︰60)，在此色谱条件下，基线稳定，羟苯甲酯与奶油香精2个色谱峰的分离度分别为5.9、6.9，且与羟苯丙酯也能很好分离；羟苯甲酯和羟苯丙酯的理论塔板数均大于7000，峰形对称。

3.2 样品处理方式 羟苯酯类防腐剂易溶于乙醇，通过预配一定浓度的乙醇溶液，再与水混合，有利于防腐剂的快速分散与溶解，因此选取乙醇作为第一步稀释的溶剂，能够较好的将待测组分溶解。然而主成分麦芽糖铁在醇中易析出，生成棕色沉淀，即游离铁，样品二步稀释之前，应先离心，再滤过，取续滤液。考虑羟苯酯类防腐剂在pH值4～8时有效，随着pH值升高，形成的苯酚基阴离子会导致活性降低[11]，故选择流动相作为其二步稀释溶剂较为合适。

3.3 标准讨论 ICH明确提出应制定防腐剂含量测定方法，但目前我国药品研发过程中一般很少对防腐剂进行质量控制，由此容易导致部分企业在防腐剂的使用上缺乏严格的管理[12]。《中国药典》2015年版四部[13]规定，糖浆剂中羟苯酯类的用量不得超过0.05%，考虑本品用量偏大，建议企业结合其抗菌防腐效力，适当降低此类防腐剂含量，同时确保药品在有效期内的微生物指标合格。本方法在测定麦芽糖铁糖浆防腐剂含量时，灵敏度高、操作简便，对于企业提升产品质量内控标准，降低质量风险具有一定意义，同时为该品种仿制药研发防腐剂处方设计提供了参考依据。

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(编校：王冬梅)

Determination of preservative in iron maltose syrup by HPLC

JIAO Xu-wen1, ZHANG Lei2, CHEN Hua1Δ

(1.Health Inspection Biochemical Laboratory,Guangdong Institute for Food and Drug Control, Guangzhou 510180, China; 2.School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of preservative in iron maltose syrup.MethodsA Kromasil 100-5 C18column was used with acetonitrile- sodium acetate buffer solution(40︰60) as the mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min and 254 nm as the detection wavelength.The column temperature was set at 30 ℃.ResultsThe calibration curve was linear within the range of 0.62～3.72 μg/mL for methyl parahydroxybenzoate, 0.18～1.07 μg/mL for propyl parahydroxybenzoate, and the linear equation wasY=228494X-2512.5,Y=203351X-3471.4, respectively.The average recovery of methyl parahydroxybenzoate, propyl parahydroxybenzoate was 100.9%(RSD=1.5%),99.6%(RSD=0.5%), respectively.ConclusionThe established method is simple, rapid and accurate, which could be used in the determination of preservative in iron maltose syrup.

iron maltose syrup; methyl parahydroxybenzoate; propyl parahydroxybenzoate; determination

广东省科技计划项目(2013B0402000029)

焦旭雯，女，硕士，主管药师，研究方向：生化药品检验，E-mail：jjxxww17@163.com；陈华，通信作者，女，硕士，副主任药师，研究方向：生化药品及生物制品质量控制，E-mail：gdchenhua@sina.com。

R917

A

1005-1678(2015)11-0169-03