中药菊花煎剂对小儿RSV感染A549细胞后趋化因子影响的研究

潘婷,朱亮

(苏州大学附属第二医院 药剂科，江苏 苏州 215000)



中药菊花煎剂对小儿RSV感染A549细胞后趋化因子影响的研究

(苏州大学附属第二医院 药剂科，江苏 苏州 215000)

目的 分析中药菊花煎剂对小儿呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus ，RSV)感染气道上皮细胞(A549细胞)后趋化因子的影响。方法 以近期苏州大学附属第二医院收治的住院小儿确诊RSV型肺炎患者64例作为研究对象，分析患儿感染RSV后的临床病症。建立RSV感染A549细胞模型，对感染后细胞进行细胞培养，加入中药菊花煎剂和常规抗病毒药观察其对RSV感染细胞的存活率影响；用ELISA试剂盒测定并比较2组细胞液中趋化因子MCP-1及RANTEs的表达情况。结果 体外细胞培养实验结果表明，中药菊花煎剂有直接的抑制病毒生长复制的作用，且存在一定的正量效应；RSV感染A549细胞后，MCP-1和RANTEs表达或释放明显增多(P<0.05)，中药菊花煎剂及抗病毒药干预后，其表达明显降低(P<0.05)，但是其总量仍显著高于正常值。结论 中药菊花煎剂能在一定程度上抑制RSV感染A549细胞释放趋化因子RANTEs和MCP-1，从而起到减轻患儿气道炎症反应的作用。

中药菊花煎剂；小儿肺炎；呼吸道合胞病毒；A549细胞；趋化因子

肺炎是威胁小儿身心健康的一类重要疾病， 又以病毒性肺炎为甚。在发展中国家，病毒性肺炎是儿童发病率最高的疾病占小儿住院疾病之首，也是6岁以下儿童死亡的重要因素[1]。小儿肺炎若未得到及时的诊治，极易发生其他并发症，如肺气肿、肺不张等，给后续治疗及预后带来很大的影响[2]。此外，某些病原体所致肺炎与小儿支气管哮喘发病密切相关，如呼吸道合胞病毒肺炎和支原体性肺炎[3]。目前，临床上针对小儿肺炎多采用西医抗病毒及对症治疗，而抗生素类药物对小儿生长发育的副作用却不容忽视。中医中药在治疗病毒性肺炎上有其独特的优势，研究表明其不仅能抑制病毒生长还具有副作用小，调节儿童免疫能力等优点。但其具体作用机制仍未明确[4-5]。为此，本研究将利用苏州大学附属第二医院病例资源，探讨分析中药菊花煎剂对防治RSV感染性肺炎的免疫机制尤其是对气道炎症的影响，为中医治疗病毒性肺炎提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 体外实验所用气道上皮细胞株(A549细胞)购于中山大学动物实验中心；细胞培养液成分均为本实验室自配(MEM中加入10%牛胎血清，浓度为100pg/mL的青霉素溶液及浓度为100pg/mL的链霉素溶液[6])；呼吸道合胞病毒(RSV)由本研究所病毒室提供。

1.2 仪器与试剂 二甲基亚枫(DMSO)和用于测定炎症因子RANTES、MCP-1、MIP-1α表达及释放量的相关酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养：培养基为含10%牛胎血清的MEM，分别加入青霉素和链霉素至100 pg/mL。加入A549细胞至25 cm2的培养瓶中，然后将培养瓶置于37 ℃，5%CO2恒温孵箱培养，每隔2～3 d进行1次培养液更换，同时进行显微镜下观察细胞生长及聚集情况，待细胞生长至融合状态时停止培养，取出进行实验。

1.3.2 A549细胞存活率的测定：采用MTT法测定感染RSV的A549细胞的存活率。分别测定药物浓度为2、4、8、16、32、64和128 μg/L的细胞存活率。将细胞培养液上清液弃去，于培养板中加入浓度为5 mg/mL的MTT液50 pL/孔，置恒温CO2培养箱中继续培养2～3 h后，弃MTT上清，用PBS液洗3次，每孔加溶解液200 μL，手动均匀进行5～10 min的震荡，观察结晶情况，待其完全溶解后放置于酶标测定仪上，分别测定中药菊花煎剂组、病毒唑组和细胞对照组细胞于570 nm波长处的光密度OD值，并根据细胞存活率[7-8]=药物组平均OD570/细胞对照组平均OD570×100%，计算各组细胞存活率。

1.3.3 中药菊花煎剂对感染RSV的A549细胞趋化因子的测定：将培养成层的A549细胞消化成单层细胞，并以0.1 mL/孔加入96孔微量细胞培养板中。接种RSV病毒后，加入含药维持液，置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养48 h，进行实验。采用酶联免疫吸附分析(ELISA)分别测定上清液中MCP-1和RANTEs的含量。

2 结果

2.1 我院近期患儿肺炎病原体感染情况 选取我院近期儿童肺炎患者共679例，进行病原体培养定型，结果表明，感染率最高的为肺炎支原体，共247例，占36.45%。本研究中选取感染率为9.40%的RSV感染患儿共64例，见表1。

表1 我院近期患儿肺炎病原体感染分布情况Tab. 1 The pathogen distribution in children with pneumonia recently in our hospital

2.2 中药菊花煎剂对RSV的抑制作用 RSV感染气道上皮细胞A549后表现为：细胞肿胀、变形、壁增厚及折光性减弱，并且可见到明显的细胞融合现象，形成合胞体。测定细胞存活率结果表明：药物浓度增加，细胞存活率下降，即病毒抑制率增高。见表1。

表1 中药菊花煎剂对RSV的抑制作用Tab.1 Inhibition of traditional Chinese medicine chrysanthemum decoction on RSV

图1 中药菊花煎剂对RSV的抑制作用Fig.1 Inhibition of traditional Chinese medicine chrysanthemum decoction on RSV

2.3 中药菊花煎剂对RSV感染A549后诱导RANTES释放作用的影响 中药菊花煎剂组RANTES的表达显著低于其他2组(P<0.05)，见表2。

表2 中药菊花对RSV感染A549细胞后诱导RANTES释放作用影响Tab.2 Influence of RANTES release by Chinese medicine chrysanthemum of RSV infecting A549 cells

*P<0.05，与细胞对照组比较，compared with control group；#P<0.05，与病毒唑组比较，compared with virazole group

2.4 中药菊花煎剂对RSV感染A549后诱导MCP-1释放作用的影响 中药菊花煎剂组MCP-1的表达显著低于其他2组(P<0.05)，见表3。

表3 中药菊花对RSV感染A549细胞后诱导MCP-1释放作用影响Tab.3 Influence of MCP-1 release by Chinese medicine chrysanthemum of RSV infecting A549 cells

*P<0.05，与细胞对照组比较，compared with control group；#P<0.05，与病毒唑组比较，compared with virazole group

3 讨论

肺部炎症目前已被世界卫生组织列为全球最常见3种儿科疾病之一[9]。就我国情况来看，小儿肺炎发病率较高，且呈日益增长趋势。若未经过及时的诊治，小儿肺炎将发生各种并发症，甚至哮喘等其他严重呼吸系统疾病[10]。西医治疗小儿肺炎常用的为病毒唑等抗病毒药，此类药效果显著，但是对小儿生长发育有着极大的影响和副作用[11]。本文利用本院资源，研究中药菊花煎剂对RSV感染A549细胞趋化因子的影响。

体外实验结果显示，中药菊花煎剂对RSV感染后的A549细胞有明显的抑制作用，当药物浓度达到128μg/L时感染细胞的存活率即以降为41.9%，与细胞对照组的96.2%相比， 差异有统计学意义(P<0.05)

RANTEs是一种由T细胞表达和分泌的正常趋化因子，可作用于单核细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞等，但中性粒细胞不受RANTEs趋化作用[13-14]。此外，RANTEs还能促进自然杀伤细胞迁移和激活记忆T细胞、单核细胞。MCP-1与RANTEs属于同一家族。研究已表明，RSV感染能促进RANTEs和MCP-1的表达和释放[15]。Babara[16]研究显示，体外实验中感染RSV的A549细胞中趋化因子RANTEs、MCP-1和MCP-1α的mRNA和蛋白表达及释放量均增加，并且与RSV感染的剂量和持续时间成正相关。

本实验研究结果提示正常人体的气道上皮细胞即可表达和释放一定量的RANTES和MCP-l等趋化因子。当RSV感染人体A549细胞后会显著增加趋化因子RANTES和MCP-l的表达量或释放量，这与其他文献[17-18]发表的研究结果相吻合，表明RSV感染性性肺炎可能通过刺激人体气道上皮细胞释放趋化因子RANTES、MCP-1，从而诱导大量炎性细胞，如单核细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞在患者气道黏膜的趋化与聚集，进而造成被感染者持续而严重的气道炎症反应[19]。本实验结果还表明通过中药菊花煎剂干预，感染RSV患者体内RANTES、MCP-1的表达与释放明显降低，但较正常细胞组而言，仍显著增加，提示临床上中药菊花煎剂治疗RSV感染性小儿肺炎的机理不仅在于药物抗病毒作用，更取决于其能在一定程度上抑制气道上皮细胞表达和释放RANTES、MCP-1等趋化因子，从而达到减轻气道炎症高反应性的作用。

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(编校：王冬梅)

Effects of traditional Chinese medicine chrysanthemum decoction on Pediatric RSV infection after A549 cell chemotactic factor

PAN Yue-ting,ZHU Liang

(Department of Pharmacy, The Second Hospital Affiliated To Suzhou University, Suzhou 215000, China)

ObjectiveTo study effect of traditional Chinese medicine chrysanthemum decoction on RSV infection after A549 cells chemotactic factor.MethodsSubjects from The Second Hospital Affilated To Suzhou University in recent days, 64 cases of patients diagnosed with RSV effected pneumonia by clinical examination, RSV infection A549 cell model was established and the infected cells were cultured, chrysanthemums with TCM decoction and conventional antiviral observed its effect on RSV infection cell survival, compared two groups of cell SAP was determined by ELISA kit and the expression of RANTEs and chemokines MCP-1.ResultsChrysanthemum, according to the results of in vitro cell culture studies traditional Chinese medicine decoction had the effect of directly inhibit the growth of virus replication, and there were some positive effects RSV infected A549 cells, MCP-1 and RANTEs expression or release significantly increased (P<0.05). Chrysanthemum Chinese medicine decoction and antiviral drugs after the intervention, the expression of MCP-1 and RANTES reduced significantly (P<0.05), but overall volume was still significantly higher than the normal.ConclusionChrysanthemum Chinese medicine decoction can inhibit RSV infected A549 cells release chemokine RANTEs and MCP-1 to some extent, and then reduce the airway inflammation reaction of children.

chrysanthemum Chinese medicine decoction;pediatric pneumonia;respiratory syncytial virus(RSV);chemokines

潘玥婷，女，大专，药师，研究方向：药剂学，E-mail:zzy9904@163.com。

R245.81

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1005-1678(2015)03-0082-03