miR-145对NSCLC细胞增殖和FSCN1蛋白表达的影响研究

牟志民,毛广显,谢远财,彭旭兴,乌达

(北京大学深圳医院 胸外科，广东 深圳 518036)



miR-145对NSCLC细胞增殖和FSCN1蛋白表达的影响研究

牟志民,毛广显,谢远财△,彭旭兴,乌达

(北京大学深圳医院 胸外科，广东 深圳 518036)

目的 研究miR-145在人非小细胞肺癌细胞 A549中的表达及其对A549细胞增殖和靶蛋白 FSCN1表达的影响。方法 采用分子克隆实验构建pmR-mcherry/miR-145真核表达载体，瞬时转染 A549细胞，QPCR法检测miR-145在细胞中的表达水平；Western blot 检测miR-145对细胞中FSCN1蛋白表达水平的影响；细胞增殖实验检测miR-145对A549细胞增殖能力的影响。结果 成功构建pmR-mcherry/miR-145真核表达载体，转染A549细胞后QPCR检测其可有效表达；Western blot结果显示过表达miR-145后，FSCN1的蛋白水平明显的下调；细胞增殖实验结果显示miR-145能明显抑制肺癌细胞A549的增殖。结论 过表达miR-145可抑制A549细胞增殖并下调FSCN1基因的表达水平。

miR-145；FSCN1；细胞增殖

肺癌居全球癌症病死率之首，非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常见的类型。研究表明肺癌5年生存率的表现仍然不佳[1]。miRNA是一类内源性非编码小分子RNA，其功能是靶向基因编码的mRNA并调节mRNA的翻译和/或降解[2]。大量研究表明，miRNAs参与许多细胞活动的调节如物质代谢、细胞增殖、细胞凋亡以及肿瘤细胞的发生、发展和分化[3-4]。miR-145是重要的抑癌分子，已知其在多种类型的恶性肿瘤中表达异常下调，包括前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌以及B细胞恶性肿瘤等。有报道证明miR-145的过表达具有生长抑制作用[5]。研究显示miR-145可通过诱导p53表达、靶向c-myc和IRS-1来抑制细胞的生长，同时具有靶向ADAM17、MUC1、Oct4和FSCN1等，抑制胚胎干细胞、癌症干细胞的增殖并调节其迁移和侵袭的多能性[6]。研究表明在临床样本中fascinhomolog1 基因(FSCN1)与 miR-145的表达水平呈负相关[7]。本实验旨在构建 miR-145真核表达载体，转染A549细胞，检测其在细胞中的表达及对肺癌细胞增殖和FSCN1)表达的影响，以期阐明miR-145在肺癌发生中的作用及可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 A549细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。

T4 DNA连接酶、感受态大肠杆菌DH5α(美国Promega公司)；限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、dNTP(日本Takara公司)；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、RIPA裂解液(东盛生物技术有限公司)；脂质体LipofectamineTM2000、Trizol(美国Invitrogen公司)；pmR-mcherry质粒(本院医学研究中心保存)；RPMI-1640培养液和胎牛血清(美国Hyclone公司)。FSCN1抗体及二抗均为英国Abcam公司产品；SYBR Green PCR Master Mix(日本TOYOBO公司)。

PRISM®7500定量PCR仪(ABI)。

1.2 方法

1.2.1 miR-145真核表达载体的构建:由miRBase网站查询获得hsa-miR-145前体序列(M10000461)，通过BLAST比对获取其基因组序列，引物设计软件primer5设计引物。引物由上海life公司合成。primer1：5’-CGgaattcGGCTGGATGCAGAAGAG-AAC-3’，primer2：5’-GCggtaaccGCCTTCTTCTTGAACCCTCA-3’。primer1中为EcoR I酶切位点，primer2中为Kpn l酶切位点。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，63 ℃退火30s，72 ℃延伸50 s，进行30个循环后，72 ℃延伸5 min。将PCR产物及pmR-mcherry质粒分别用EcoR I和Kpn l进行双酶切，用T4连接酶将酶切回收的产物16 ℃连接过夜，次日转化至DH5α大肠杆菌感受态中，挑选阳性克隆并进行双酶切鉴定后送测序验证。

1.2.2 细胞培养及转染：A549细胞用RPMI1640培养液+10%胎牛血清中于37 ℃，5%CO2及一定湿度下进行常规培养，细胞密度为105个/mL，每孔2 mL细胞悬液。待6孔板中的细胞生长密度达70%～80%时，用lipofectamine转染试剂盒分别将pmR-mcherry/miR-145、pmR-mcherry空载体转染至A549细胞，具体步骤参照转染试剂盒说明书。每孔质粒量为0.5 ug，终浓度为150 nmol/L。

1.2.3 定量PCR检测miR-145在A549细胞中的表达：转染pmR-mcherry/miR-145过表达载体24 h后，提取细胞总RNA，oligo dT法反转录后进行定量PCR检测。miR-145茎环引物为：上游5’-acactccagctgggtttgggagtct-3’，下游5’-ctcaactggtgtcgtgga-3’。U6基因为内参：上游5’-ctcgcttcggcagcaca-3’，下游5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’。PCR扩增条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火和延伸60 s，共40个循环。每个样重复3次。

1.2.4 Western blot检测FSCN1蛋白表达：收集转染miR-145 72 h的A549细胞；RIPA裂解液裂解细胞得到总蛋白；BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳；5%的脱脂奶粉37 ℃封闭1 h；TBST洗10 min，重复3次，然后加1∶1000稀释的一抗(Abcam，英国)室温孵育1 h；TBST洗10 min，3次，加1:4000稀释的二抗(Abcam，英国)，室温孵育1 h；TBST洗10 min，3次；BCL显影，曝光。

1.2.5 miR-145对A549细胞增殖能力的影响：分别收集转染0、24、48、72、96 h后的A549细胞，进行细胞生长曲线测定。在0.08 mL台盼蓝(含0.1% Trypan blue的PBS)中加0.2 mL细胞悬液，立即用微量巴氏吸管混匀后，吸足量细胞悬液从血细胞计数室的一边加样；使用Freshney计数板计算细胞数。

2 结果

2.1 载体构建 pmR-mcherry/miR-145载体构建结果见图1。PCR特异扩增出的miR-145前体片段条带和目标条带大小及位置一致(line 1)。重组质粒经限制性内切酶KpnⅠ和EωRI双酶切，可获得约4500 bp和200 bp的条带(line 2)，说明miR-145前体片段已成功连接至cherry空质粒中；测序结果与GeneBank中的miR-145前体序列一致，表明重组质粒pmR-mcherry/miR-145构建成功(结果未显示)。

图1 pmR-mcherry/miR-145载体构建电泳结果M：DL 500 bp Marker；1：miR-145前体片段PCR产物；2：pmR-mcherry/miR-145双酶切产物Fig.1 Electrophoresis results of recombinant plasmid pmR-mcherry/miR-145M:DL 500 bp Marker; 1.PCR product of miR-145 precursor;2.Restrictive enzyme digestion products of pmR-mcherry/miR-145

2.2 miR-145表达水平检测 QPCR法检测pmR-mcherry/miR-145重组质粒转染A549细胞24 h后miR-145的表达结果见图2。转染重组质粒A549的细胞miR-145的表达量远高于转染空质粒组(P<0.01)，说明miR-145在A549细胞中得到过表达，可以用于后续检测实验。

图2 miR-145的相对表达量Fig.2 Relative expression of miR-145

2.3 miR-145对FSCN1蛋白水平的影响 采用Western blot检测过表达miR-145对FSCN1蛋白表达的影响。结果显示：重组质粒组中FSCN1的表达量明显低于空质粒组和空白对照组(均P<0.05)；空质粒组中FSCN1的表达量与空白对照组无明显差别。说明过表达miR-145后，FSCN1蛋白水平的表达出现明显下调，见图3。

图3 Westernblot检测FSCN1蛋白表达水平Fig.3 Relative expression of FSCN1 protein

2.4 过表达miR-145对A549细胞增殖能力的影响 细胞增殖实验结果显示，A549细胞转染miR-145重组质粒72 h后，miR-145重组质粒组对A549细胞增殖的抑制明显强于对照组(P<0.05)，在96 h抑制作用更为明显(P<0.05)，见图4。说明miR-145可能通过下调FSCN1的表达水平来抑制肺癌细胞A549的增殖。

图4 过表达miR-145对A549细胞增殖能力的影响Fig.4 Effect of miR-145 overexpression on A549 cell proliferation

3 讨论

肺癌是发病率最高的恶性肿瘤之一，尽管在诊断和治疗方面有很大的进步，但其仍是癌症死亡的主要原因，肺癌中近85%的患者为非小细胞肺癌[8]。FSCN1是一种将细胞内F-肌动蛋白组织成有序的，紧密的平行束的分子量为55 kDa的球状蛋白[9]。脊椎动物基因组中存在3种形式的FSCN：FSCN1，在间充质组织和神经系统中广泛表达； FSCN2，由视网膜感光细胞表达；FSCN3，具有睾丸特异性。FSCN1为负责介导细胞间相互作用和细胞内运动的细胞质微丝束。最近研究表明，在肿瘤患者身体的许多部位中均检测到FSCN为1蛋白的上调[10]。在非小细胞肺癌和胃腺癌的研究显示，带瘤生存率较差与肿瘤中FSCN1的高表达相关[11-13]。

本实验通过构建pmR-mcherry/miR-145真核表达载体，瞬时转染 A549细胞，发现过表达miR-145后，FSCN1的蛋白水平明显的下调；细胞增殖实验结果显示miR-145能明显抑制肺癌细胞A549的增殖。表明miR-145抑制A549细胞的增殖很可能是通过调节A549细胞中FSCN1蛋白的表达水平实现的。在后续实验中将进一步探讨miR-145在肺癌细胞侵袭转移中的作用，以期为肺癌的临床诊断和生物治疗提供理论依据。

[1] Akao Y,Nakagawa Y,Kitade Y,et al.Downregulation of microRNAs-143 and -145 in B-cell malignancies[J].Cancer Sci,2007,98(12):1914-1920.

[2] Sachdeva M,Zhu S,Wu F,et al.p53 repressesc-Myc through induction of the tumor suppressor miR-145[J].Proc Natl Acad Sci,2009,106(9):3207-3212.

[3] La Rocca G,Badin M,Shi B,et al.Mechanism of growth inhibition by MicroRNA 145:the role of the IGF-I receptor signaling pathway[J].J Cell Physiol,2009,220(2):485-491.

[4] Xu N,Papagiannakopoulos T,Pan G,et al.MicroRNA-145 regulates OCT4,SOX2,and KLF4 and represses pluripotency in human embryonic stem cells[J].Cell,2009,137(4):647-658.

[5] Jia Y,Liu H,Zhuang Q,et al.Tumorigenicity of cancer stem-like cells derived from hepatocarcinoma is regulated by microRNA-145[J].Oncol Rep, 2012,27(6):1865-1872.

[6] Lu Y,Chopp M,Zhang X,et al.MiR-145 reduces ADAM17 expression and inhibits in vitro migration and invasion of glioma cells[J].Oncol Rep,2012,29(1):67-72.

[7] Peng X,Guo W,Liu T,et a1．Identification of miR-143 and-145 that is associated with bone metastasis of postate cancer and involved in the regulation of EMT[J].PLoS One,2011,6(5)：e20341.

[8] Sachdeva M,Mo YY.miR-145-mediated suppression of cell growth,invasion and metastasis[J].Am J Transl Res,2010,2(2):170-180.

[9] Kano M,Seki N,Kikkawa N,et al.miR-145,miR-133a and miR-133b:Tumor suppressive miRNAs target FSCN1 in esophageal squamous cell carcinoma[J].Int J Cancer,2010,127(112):2804-2814.

[10] Ichimi K,Enokida H,Okuno Y,et al.Identification of novel microRNA targets based on microRNA signatures in bladder cancer[J].Int J Cancer,2009,125(2):345-352.

[11] Artym VV,Yamada KM,Mueller SC.ECM degradation assays for analyzing local cell invasion[J].Methods Mol Biol,2009,522:211-219.

[12] Jemal A,Murray T,Ward E,et al.Cancer statistics,2005[J].CA Cancer J Clin,2005,55(1):10-30.

[13] Wakelee HA,Bernardo P,Johnson DH,et al.Changes in the natural history of nonsmall cell lung cancer (NSCLC)-comparison of outcomes and characteristics in patients with advanced NSCLC entered in Eastern Cooperative Oncology Group trials before and after 1990[J].Cancer,2006,106(10):2208-2217.

(编校：吴茜)

Effect of miR-145 on NSCLC cell proliferation and FSCN1 protein expression

MU Zhi-min,MAO Guang-xian,XIE Yuan-cai△,PENG Xu-xing,WU Da

(Department of Thoracic Surgery, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, China)

ObjectiveTo investigate the effect of miR-145 on human lung adenocarcinaoma A549 cell proliferation and FSCN1 expression.MethodspmR-mcherry/miR-145 was constructed and transfected into A549 cell，then the expression of miR-145 and the proliferation of A549 cell were verified by QPCR and MTS assay, respectively．The situation of FSCN1 expression in A549 cell was detected by Western blot.ResultspmR-mcherry/miR-145 vector was constructed successfully，and QPCR results indicated that miR-145 expressed effectively.Western blot results showed that FSCN1 was one of the targets of miR-145 in A549 cell．MTS assay results indicated that miR-145 inhibited the proliferation of A549 cell.ConclusionOverexpression of miR-145 can inhibit the proliferation of A549 cell, and FSCN1 was one of its target.

miR-145;fascinhomolog1;cell proliferation

深圳市科技计划项目(JCYJ20140415162338820);深圳市医疗卫生科研项目(201302068)

牟志民，男，学士，副主任医师，研究方向:胸外科，E-mail：szmzm416@126.com；谢远财，男，通讯作者，博士，主任医师，研究方向：胸外科疾病，E-mail：xieyuancai2005@126.com。

R734.2

D

1005-1678(2015)03-0025-03