沙利度胺对急性白血病患者外周血调节性T细胞的影响及其临床疗效评价

夏轶姿，朱宝玲，汤鲁明，邢超，陈慧，邵美娟

(1.温州医科大学附属第二医院 急诊科，浙江 温州 325027；2.温州医科大学附属第二医院 血液科，浙江 温州 325027；3.温州医科大学附属第二医院 检验科，浙江 温州 325027)



沙利度胺对急性白血病患者外周血调节性T细胞的影响及其临床疗效评价

夏轶姿1Δ，朱宝玲2，汤鲁明1，邢超3，陈慧3，邵美娟3

(1.温州医科大学附属第二医院 急诊科，浙江 温州 325027；2.温州医科大学附属第二医院 血液科，浙江 温州 325027；3.温州医科大学附属第二医院 检验科，浙江 温州 325027)

目的 评定沙利度胺(thalidomide)对急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)患者CD4+CD25+T淋巴细胞的影响及其临床疗效。方法 将71例AML患者随机分为常规化疗方案对照组(37例)和沙利度胺加常规化疗方案治疗组(34例)，另有31例健康者纳入正常组。治疗组和对照组患者均接受相同化疗方案，其中治疗组加用沙利度胺。分别检测治疗前、第二疗程化疗结束后10～14d、完全缓解后随访6个月或随访过程中复发时血清CD4+CD25+T淋巴细胞、CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+/CD8+比值、NK细胞水平，正常组于对应化疗前及化疗结束后10～14d检测相同指标。观察治疗组和对照组患者临床疗效。结果 治疗组有效缓解率较对照组高(P<0.05)；治疗组和对照组患者治疗前CD4+CD25+T淋巴细胞水平均明显高于正常组(P<0.05)，治疗后2组均下降(P<0.05)；与对照组相比，治疗组CD4+CD25+T淋巴细胞水平明显降低(P<0.05)。加用沙利度胺治疗后，治疗组在CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD4+/CD8+比值、NK细胞水平均明显高于对照组(P<0.05)。结论 沙利度胺可改善AML患者细胞免疫功能和提高临床缓解有效率，机制与下调CD4+CD25+T淋巴细胞水平相关。

沙利度胺；急性髓细胞白血病；CD4+CD25+T淋巴细胞；肿瘤免疫

急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)是造血系统非淋巴细胞的恶性肿瘤，多数患者经过正规治疗后仍残存部分白血病细胞(minimal residual disease，MRD)，此时自身的免疫系统在清除MRD的过程中发挥重要作用。CD4+CD25+T淋巴细胞(CD4+CD25+Treg)是近年来鉴定的一种新型免疫抑制细胞，有学者发现AML患者外周血中 CD4+CD25+Treg比例明显高于正常人，并推测CD4+CD25+Treg在AML发生发展中起到一定作用[1-3]。沙利度胺(thalidomide)作为一种合成的谷氨酸衍生物，具有免疫调节、抗炎及抗血管生成等重要作用[4-5]。研究认为沙利度胺可以通过调节免疫系统、抑制炎症反应等方式对血液系统肿瘤有一定的疗效[6-7]。本研究拟通过观察沙利度胺对AML患者的免疫功能的调节并进一步探索沙利度胺的作用机制，为探索AML的免疫调理治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年6月至2014年6月温州医科大学附属第二医院血液科新发、复发或难治的AML病患者71例，其中年龄51～67岁，平均(56.1±8.1)岁；男性43例，女性28例。按照FAB分型(法国、美国和英国)三国血细胞形态学专家讨论、制订了关于急性白血病的分型诊断标准，简称“FAB”分型，M1型7例，M2型12例，M3型27例，M4型21例，M5型4例。所有患者的诊断均根据临床、细胞形态学、病理、免疫学资料及遗传学检查做出诊断。按随机化数字表原则，入科后疾病诊断符合AML诊断标准后立刻纳入研究，按照患者入住血液科日期分为治疗组(34例)与对照组(37例)。治疗组男性22例，女性12例，年龄50～66岁，平均年龄(56.0±7.4)岁，M1型3例，M2型6例，M3型11例，M4型12例，M5型2例。对照组男性21例，女性16例，年龄51～67岁，平均年龄(56.2±7.8)岁，M1型4例，M2型6例，M3型16例，M4型9例，M5型2例。选取同期本院健康体检患者30例，男性15例，女性15例，年龄50～67岁，平均(55.1±7.9)岁。治疗组与对照组一般资料比较差异无统计学意义，具有可比性。排除伴有其他恶性肿瘤、严重肝肾功能不全、严重代谢性疾病及治疗不配合患者。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法：所有患者按照随机化原则分为治疗组(34例)和对照组(37例)，治疗组确诊后立即进行常规化疗方案并开始服用沙利度胺片(常州制药厂有限公司，国药准字H32026129)，起始剂量从50 mg/d，1周后可加量至100 mg/d，若病人无不能耐受的毒副作用，在加量至200 mg/d后一直服用至全部化疗结束。对照组化疗方案同实验组，但无沙利度胺。正常组不做药物处理。

1.2.2 样品采集：根据张之南《血液病疗效及诊断标准》[8]，将白血病分为完全缓解，部分缓解，未缓解。完全缓解：白血病的症状、体征消失；血象和骨髓象基本正常，中性粒细胞绝对值≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L，外周血分类中无白血病细胞；骨髓象原始、幼稚白血病细胞≤5%，红系、巨核系正常。部分缓解：骨髓中原始细胞为5%～20%，外周血标准同CR。未缓解(NR)：骨髓中原始细胞≥20%。

1.2.3 外周血CD4+CD25+Treg水平测定：2组患者于治疗前(T1)、第二疗程化疗结束后10～14 d(T2)、完全缓解后随访6个月或随访过程中复发时(T3)，分别抽取外周血；正常组于治疗组和对照组化疗前及化疗结束后10～14 d(T2)对应时间抽取外周血，乙二胺四乙酸二钾抗凝。取50 μL血液标本，每管中加入10 μLCD4-FITC、5 μLCD25-PE、10 μLCD127-PECy5后混匀，室温避光孵育30 min，加1 mL细胞裂解液混匀，PBS洗涤2次，低速离心5 min，去上清液后加入200 μL PBS液，重悬后用Handyem流式细胞仪(北京四正柏生物科技有限公司)进行检测。

1.2.4 外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及NK细胞的检测：抽取患者空腹血2 mL，肝素抗凝。直接免疫荧光标记法，100 μL全血CD3-FITC/CDl6CD56PE荧光双标记单克隆抗体放入试管中，混匀后室温避光放置30 min，低速离心5 min弃去上清液，PBS洗涤后上机检测(DF-100荧光光谱仪，上海仁特检测仪器有限公司)。

2 结果

2.1 临床疗效比较 71例患者均于第二疗程化疗结束后10～14 d后评价疗效，治疗组有效病例继续口服沙利度胺。治疗组中，完全缓解28例，部分缓解4例，未缓解2例，有效率94.12%。对照组中，完全缓解25例，部分缓解3例，未缓解9例，有效率75.68%。2组间疗效差异有统计学意义(χ2=4.603，P<0.05)。

2.2 各组患者外周血CD4+CD25+Treg水平比较 治疗前2组患者CD4+CD25+Treg水平差异无统计学意义，但均高于正常组(P<0.05)；治疗后2组患者CD4+CD25+Treg水平较治疗前均降低，但仍高于正常组(P<0.05)，其中治疗组CD4+CD25+Treg水平明显低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 3组患者不同时间点CD4+ CD25+ Treg细胞的比较Tab.1 Comparison of CD4+ CD25+ Treg in serum of different point of three groups(±s)

#P<0.05，与同组治疗前比较，compared with the same group pre-treatment；*P<0.05，与对照组同期比较，compared with control group same period

2.3 各组患者外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞水平比较 患者治疗前CD3+、CD4+、NK细胞比例及CD4/CD8比值较正常组明显偏低(P<0.05)；CD8+较正常人升高(P<0.05)。2组患者治疗后CD3+、CD4+、NK细胞比例及CD4/CD8比值较治疗前明显升高(P<0.05)；CD8+治疗前后无显著变化，差异无统计学意义。与对照组治疗后相比，治疗组患者CD3+、CD4+、NK细胞比例及CD4+/CD8+比值明显升高(P<0.05)；CD8+无明显变化，差异无统计学意义。见表2。

表2 3组患者不同时间点血清T淋巴细胞亚群及NK细胞的比较

#P<0.05，与同组治疗前比较，compared with the same group pre-treatment；*P<0.05，与对照组同期比较，compared with control group same period

3 讨论

AML的微环境具有免疫抑制性和抗细胞凋亡的特性，而其中的免疫抑制性又包括免疫细胞和免疫分子[9]。自身免疫系统能够积极对抗白血病细胞，对免疫系统进行调节可能提高肿瘤患者的生存率[10]。阐明自身免疫的作用机制，对于提出新的肿瘤治疗方案以及进一步探讨肿瘤发生发展规律具有非常重要的意义。

本研究采用随机对照临床研究，观察沙利度胺对AML患者免疫功能及预后的影响。研究结果提示，2组AML患者治疗后，T淋巴细胞亚群及NK细胞水平均治疗前有升高(P<0.05)，研究组升高程度大于对照组(P<0.05)，提示随时间延长，2组患者自身免疫功能改善，而研究组改善明显，提示沙利度胺能促进T淋巴细胞亚群及NK细胞水平重新达到平衡，使机体免疫状态得到改善，进一步说明，沙利度胺对AML患者抑制状态的免疫功能起到调节作用。此外，2组患者有效缓解率相比，研究组明显优于对照组(P<0.05)，提示沙利度胺联合常规化疗能改善AML患者预后。

CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(CD4+CD25+Treg)具有免疫无能性及免疫抑制性，可以抑制效应性CD4+细胞、CTL和NK细胞，在肿瘤免疫逃逸和抗肿瘤免疫中起着重要的作用。国外研究中发现血AML患者外周血CD4+CD25+Treg比例明显升高，其升高程度与病程及预后呈正相关[11]。此外，Zhou[12]等发现在鼠类AML模型中降低CD4+CD25+Treg水平可以提高T细胞亚群在体外的功能，且有利于提高疗效。本研究中治疗组和对照组患者CD4+CD25+Treg比例明显高于正常组(P<0.05)。经沙利度胺之后，治疗组患者CD4+CD25+Treg比例较对照组明显下降，提示沙利度胺可以下调患者CD4+CD25+Treg的表达并解除AML患者的免疫抑制状态，阻止肿瘤细胞的逃逸。

本研究表明沙利度胺联合化疗可提高AML的缓解率，其主要通过下调CD4+CD25+Treg水平，改善其它免疫细胞功能从而发挥其抗AML作用，同时这一结果为寻找新的治疗AML的途径奠定了理论基础，抑制CD4+CD25+Treg的功能可为AML的治疗开辟新的途径。

[1] Suto A,Nakajima H,Kagami SI,et al.Role of CD4CD25 regulatory T cells in Th2 cells mediated allergic inflammation in the airways[J].Am J Respir Crit CareMed,2001,164:680-687.

[2] Beyer M,Sehultze JL.Regulatory T cells in cancer[J].Blood,2006,108(3):804-811.

[3] JaviaL LR,Rosenberg SA.CD4+CD25+ suppressor lymphocytes in the circulation of patients immunized against melanoma antigens[J].J Immunol ther,2003,26(l):85-93.

[4] Eichholz A,Merchant S,Gaya A M.Anti-angiogenesis therapies:their potential in cancer management[J].OncoTargets and therapy,2010,3:69.

[5] Keyhani A,Jendiroba D B,Freireich E J.Angiogenesis and leukemia[J].Leukemia research,2001,25(8):639-645.

[6] Gupta D,Treon S P,Shima Y,et al.Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion:therapeutic applications[J].Leukemia,2001,15(12):1950-1961.

[7] Ye Q,Chen B,Tong Z,et al.Thalidomide reduces IL-18,IL-8 and TNF-α release from alveolar macrophages in interstitial lung disease[J].European Respiratory Journal,2006,28(4):824-831.

[8] 张之南.血液病疗效及诊断标准[M].北京：北京科学出版社，1998:210-215，347-348.

[9] Mato A R,Morgans A,Luger S M.Novel strategies for relapsed and refractory acute myeloid leukemia[J].Current opinion in hematology,2008,15(2):108-114.

[10] Beyer M,Schultze J L.Regulatory T cells in cancer[J].Blood,2006,108(3):804-811.

[11] Prabhala RH,Neri P,Bae JE,et al.Dysfunctional T regulatory cells in multiple myeloma[J].Blood,2006,107(1):301-304.

[12] Zhou Q,Bucher C,Munger M E,et al.Depletion of endogenous tumor-associated regulatory T cells improves the efficacy of adoptive cytotoxic T-cell immunotherapy in murine acute myeloid leukemia[J].Blood,2009,114(18):3793-3802.

(编校：谭玲)

Effect of thalidomide on peripheral blood regulatory T cells and evaluation of its clinical effect in patients with acute myelocytic leukemia

XIA Yi-zi1Δ, ZHU Bao-ling2, TANG Lu-ming1, XING Chao3, CHEN Hui3, SHAO Mei-juan3

(1.Department of Emergency,The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wezhou 325027, China;2.Department of Hematology,The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wezhou 325027, China;3.Department of Laboratory, The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wezhou 325027, China)

ObjectiveTo evaluate of impact of thalidomide on CD4+CD25+T lymphocytes in patients with acute myeloid leukemia and its clinical curative effect.Methods71 cases of patients with AML were randomly divided into the control group and the experiment group, and 31 healthy people were selected to be the normal group. The experiment group and the control group patients were treated with the same chemotherapy, the experiment group was treated with thalidomide. The levels of CD4+CD25+T lymphocyte, CD3+T lymphocyte, CD4+T lymphocyte, CD8+T lymphocyte, ratio of CD4+/CD8+and NK cells were detected at before treatment, 10 to 14d after treatment, complete remission 6 months follow-up. In normal group, the same index was detected before and after chemotherapy, and 10-14 d. The clinical curative effect of the experiment group and the control group were observed.ResultsThe effective rate of the experiment group was higher than of the control group(P< 0.05); The levels of CD4+CD25+T lymphocyte in the experiment group and control group were significantly higher than in the normal group(P< 0.05), the two groups decreased compared with the control group, the level of CD4+CD25+T lymphocyte in the experiment group was significantly decreased(P< 0.05). And with thalidomide treatment, the experiment group in the CD3+T lymphocytes, CD4+T lymphocytes and ratio of CD4+/CD8+, NK cells were significantly higher than the control group(P< 0.05).ConclusionThalidomide can improve both the immunity cell function and the clinical efficiency in patients with AML. The mechanism is related to reduce the level of CD4+CD25+T lymphocyte.

thalidomide; acute myeloid leukemia; CD4+CD25+T lymphocyte; tumor immunity

2012年度温州市科技计划项目(Y20120051)

夏轶姿，通信作者，女，本科，主治医师，研究方向：血液肿瘤学，E-mail：wenzhouxiayizi@163.com。

R552

A

1005-1678(2015)11-0061-03