加味真武汤对阿霉素诱导心衰大鼠模型的保护作用及其机制

游广辉

(郑州人民医院 药学部，河南 郑州 450003)



加味真武汤对阿霉素诱导心衰大鼠模型的保护作用及其机制

游广辉Δ

(郑州人民医院 药学部，河南 郑州 450003)

目的 研究加味真武汤对阿霉素诱导的大鼠心衰模型的保护作用并探讨其机制。方法 尾静脉注射阿霉素建立心衰模型，于1、3、5周注射阿霉素3 mg/kg，于2、4、6周尾静脉注射阿霉素2 mg/kg，共注射6次。60只大鼠随机分为6组，每组10只，分别为空白对照组，模型组，加味真武汤高、中、低剂量组(40、20、10 g生药/kg，灌胃)，氢氯噻嗪(阳性药物)组(10.78 mg/kg，灌胃)。观察动物一般状况，24 h尿量、尿液中Na+、K+及Cl-含量，比较各组心功能，血浆中血管紧张素(angiotensin，AngⅡ)、醛固酮(aldosterone，ALD)、抗利尿激素(antidiuretic hormone，ADH)含量的变化。大鼠处死后取心脏，常规HE染色，进行病理组织学检查。结果 给予加味真武汤后，给药组大鼠摄食、活动等较未给药前改善。与模型组相比，加味真武汤高、中、低剂量组24h尿量、尿液中Na+及K+含量均不同程度增加(P<0.05)，但Cl-含量无显著变化，降低左心室舒张末期压力(left ventricular end dilated pressure，LVEDP)，升高左室内压峰值(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室压力上升最大速率(+dp/dtmax)及左室压力下降最大速率(-dp/dtmax)(P<0.05)，降低AngⅡ、ADH及ALD水平(P<0.05)。病理结果显示，模型组心肌细胞明显受损并有单核、淋巴细胞浸润，高剂量组、阳性组心肌细胞基本恢复正常，中、低剂量组有一定程度的改善。结论 加味真武汤改善心衰大鼠的心功能，此作用可能与其降低AngⅡ、ALD、ADH水平，促进Na+、K+排泄，从而增加尿量有关。

加味真武汤；心衰；大鼠；保护作用

充血性心力衰竭是由多种病因所致的心脏排血功能不足，无法满足机体各组织的需要，以致血液和体液的瘀积，出现气急、水肿等临床症状。中医认为心衰的病因多半为心肾阳虚，血瘀水停之症[1]。真武汤源自《伤寒论》，是公认的治疗少阴阳虚水泛之症的良方，广泛应用于临床以水液代谢失调为主的病症，前人虽对真武汤利水作用机制进行过探讨[2]，但未见对真武汤治疗充血性心力衰竭进行系统、深入的机制方面的探讨。本研究根据经典的真武汤方子，依据文献[3]制成加味真武汤，本文拟研究加味真武汤对阿霉素心衰模型大鼠的作用并首次从利尿角度探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SD大鼠60只，雄性，7～8周龄，体质量180～220 g，由河南省实验动物中心提供，质量合格证号41003100000439。本实验遵循《实验动物保护条例》相关规定。

1.1.2 试剂与仪器：注射用盐酸阿霉素(浙江海正药业股份有限公司，批号：121104)，以0.9%NaCl配制成1.5 mg/mL及1.0 mg/mL浓度备用。氢氯噻嗪片(常州制药有限公司，批号：12061712)，以0.5%的CMC-Na配制成5.39 mg/ mL混悬液备用。戊巴比妥钠(德国Merck公司，批号：K2208)，肝素钠(常州千红生化制药股份有限公司，批号：130606)，加味真武汤剂(组方：附子12 g，桂枝10 g，人参10 g，黄芪15 g，茯苓15 g，芍药12 g，白术15 g，生姜15 g，川穹15 g，丹参18 g，泽泻10 g)由郑州人民医院药剂科加工，生药浓度为3 g/mL。HE染色液(北京索莱宝科技有限公司)，ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

RM-6240型多道生理记录仪(成都仪器厂)，A3原子吸收分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，ICS-90离子色谱仪(赛默飞世尔科技公司)，H1-Synegy型多功能酶标仪(Gene Company Limited)，LEICA RM2235型生物组织切片机(德国LEICA公司)，XSP-24N型光学显微镜(南京江南光电集团股份有限公司)，DM-BA300数码生物显微镜(厦门麦克奥迪公司)。

1.2 方法

1.2.1 阿霉素模型的制备：正式实验前1个月先进行预实验，取10只动物按文献方法[4-6]用阿霉素尾静脉注射造模，即分别于1、3、5周尾静脉注射阿霉素溶液3 mg/kg，于第2、4、6周尾静脉注射阿霉素2 mg/kg，共注射6次。造模结束颈总动脉插管测动物心功能，取心脏，常规HE染色，进行病理组织学检查。以心功能严重下降，病理镜检心肌呈慢性心衰样病变为造模成功标志。本实验中造模成功率约为90%。

60只大鼠随机分为6组，每组10只，分别为空白对照组，模型组，加味真武汤高、中、低剂量组，氢氯噻嗪(阳性药物)组。除空白对照组外，其余5组按上述方法造模。空白对照组尾静脉注射等体积0.9%NaCl溶液，尾静脉注射体积约为0.2 mL/100g体质量。

1.2.2 给药途径及剂量：于末次注射阿霉素后给予药物进行干预。空白对照组和模型组给予0.5% CMC-Na，加味真武汤高、中、低剂量组给予40、20、10 g生药/kg，氢氯噻嗪组给予氢氯噻嗪片10.78 mg/kg，共给药2周。使用0.5%的CMC-Na稀释混悬生药原液及氢氯噻嗪片，灌胃给药，给药容积约为2 mL/200 g体质量。

1.2.3 观测指标：

①一般情况：给药期间观察动物的一般活动及生存率；

② 24 h尿量及尿液中Na+、K+及Cl-浓度检测：给药结束后用大鼠代谢笼收集24 h尿液，原子吸收分光光度计测尿液中Na+、K+的浓度，离子色谱仪测Cl-浓度；

③ 心功能指标检测：用3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉动物，颈总动脉插管，用多道生理记录仪记录左心室舒张末期压力(left ventricular end dilated pressure，LVEDP)、左室内压峰值(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室压力上升最大速率+dp/dtmax及左室压力下降最大速率-dp/dtmax；

④ 血管紧张素(angiotensin，AngⅡ)、醛固酮(ALD)、抗利尿激素(antidiuretic hormone，ADH)含量检测：腹主动脉取血5 mL，EDTA抗凝，1000 g离心10 min，按照双抗两步夹心酶联免疫法(ELISA)，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)显色，450 nm处测血浆中AngⅡ、ALD、ADH的含量；

⑤ HE染色：处死大鼠后，快速取出心脏置于0.9%NaCl溶液中洗去血液。取心室心肌组织4%多聚甲醛固定液内，常规石蜡包埋，取左心室肌切片，进行HE染色，光镜观察。

2 结果

2.1 真武汤对阿霉素心衰大鼠一般状态的影响 自造模第6天起，除对照组外，各组大鼠均出现不同程度的进食减少，被毛无光泽、体质量下降，自发活动减少等现象，以模型组为甚。实验过程中，模型组有2只大鼠死亡，中、低剂量组各有1只动物死亡，解剖发现动物有明显腹水、胀气。给予加味真武汤后，给药组存活动物摄食、活动较未给药前改善。

2.2 加味真武汤对阿霉素心衰大鼠24 h尿量和尿液中Na+、K+、Cl-含量的影响 与空白对照组相比，模型组大鼠24 h尿量、尿液中Na+、K+的含量显著降低，Cl-含量显著升高(P<0.01)。与模型组相比，加味真武汤高、中、低剂量及氢氯噻嗪组24 h尿量、尿液中Na+及K+含量均显著增加(P<0.01)。氢氯噻嗪组尿液中Cl-含量显著增加(P<0.01)。见表1。

表1 加味真武汤对阿霉素心衰大鼠24 h尿量和尿液中Na+、K+、Cl-含量的影响Tab.1 Effect of Jiawei Zhenwu decoction on 24h urine volume, Na+, K+ and Cl- contents of rats with heart failure induced by adriamycin(±s)

*P<0.05，与空白对照组比较，compared with blank control group；#P<0.05，与模型组比较，compared with model group

2.3 加味真武汤对阿霉素心衰大鼠心功能的影响 与空白对照组相比，模型组大鼠LVEDP明显升高(P<0.05)，LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax均显著降低(P<0.01)。加味真武汤高、中剂量及氢氯噻嗪组均可明显降低LVEDP，升高LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax(P<0.01)。加味真武汤低剂量组显著升高LVSP、降低LVEDP(P<0.01)，但对+dp/dtmax及-dp/dtmax无显著影响。此结果显示加味真武汤可改善阿霉素心衰大鼠心功能，具有一定的剂量依赖性。见表2。

表2 加味真武汤对阿霉素心衰大鼠心功能的影响

**P<0.01，与空白对照组比较，compared with blank control group；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较，compared with model group

2.4 加味真武汤对阿霉素心衰大鼠血浆中AngⅡ、ALD及ADH的含量的影响 与空白对照组相比，模型组大鼠血浆中AngⅡ、ALD及ADH的含量明显升高(P<0.01)。与模型组相比，加味真武汤高、中剂量组及氢氯噻嗪组AngⅡ、ADH及ALD水平显著降低(P<0.01；P<0.05)。加味真武汤低剂量组显著降低AngⅡ、ADH水平(P<0.01)，但对ALD水平无显著影响。见表3。

表3 加味真武汤对阿霉素心衰大鼠血浆AngⅡ、ALD及ADH含量的影响Tab.3 Effect of Jiawei Zhenwu decoction on AngⅡ, ALD and ADH contents of rats with heart failure induced by adriamycin(±s)

**P<0.01，与空白对照组比较，compared with blank control group；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较，compared with model group

2.5 加味真武汤对大鼠心肌细胞的影响 病理镜检结果显示，空白对照组大鼠心肌细胞排列整齐，无心肌纤维的破坏，细胞间隙正常，未见水肿(见图1A)。模型组心肌细胞多灶性肌浆溶解，有不同程度的颗粒变性与空泡变性，细胞间隙明显增宽，受累较重的心肌细胞肌原纤维溶解消失，呈小灶状或片状坏死，心肌坏死灶内可见单核、淋巴细胞浸润(见图1B)。各给药组心肌细胞损害程度较模型组有不同程度的减轻。高剂量组、阳性组仅见心肌纤维颗粒变形，未见肌浆坏死溶解和炎性浸润，基本恢复正常(见图1C、1D)。中剂量组、低剂量组心肌细胞多灶性坏死溶解、炎性细胞浸润等病变程度较模型组减轻，有一定程度的改善(见图1E、1F)。

图1 大鼠心肌病理切片HE染色结果(HE，×400)Fig.1 HE staining result of myocardial pathological section of rats(HE，×400)

3 讨论

充血性心力衰竭属心悸、胸痹、喘症、水肿等范畴，为临床常见病及多发病。《黄帝内经》名之曰“水”。所论“水”之惊悸，喘呼、咳喘不能平卧、卧则喘甚，足胫肿，甚则腹大，颈脉张而动等症状，极符合现代所论之心衰[7-8]。真武汤是医圣张仲景《伤寒论》中温阳利水代表方，主治“少阴病阳虚水泛证”。充血性心力衰竭心排出量不足时，末梢循环减弱，与少阴病心肾阳虚推血无力，阳气不能温煦四肢的见症是相同的[9]。据此许多学者应用真武汤治疗CHF取得了显著疗效[10]。加味真武汤在经典组方茯苓、附子、白术、生姜、白芍的基础上加入桂枝、人参、川芎、丹参、黄芪等组成。诸药相伍温中有散，利中有化，脾肾双补，阴水得制，具有益气温阳、强心活血利水、标本兼治的功效[3]。

经过造模后阿霉素模型组大鼠心功能降低(P<0.01)，尿量减少(P<0.01)，Na+、K+排出减少(P<0.01)，AngⅡ、ALD、ADH增高(P<0.01)，结合病理结果提示用阿霉素制作心衰模型是成功的。本试验发现，经过治疗后阿霉素心衰大鼠心功能明显改善，左心收缩功能、舒张功能明显上升(P<0.01)。

本试验所用对照药物氢氯噻嗪为中效利尿剂，长期应用可减轻心脏负荷，临床上常用于充血性心力衰竭的治疗。本试验发现加味真武汤和氢氯噻嗪均可增加阿霉素所致的心衰大鼠24h尿量(P<0.05)，且加味真武汤高剂量的利尿作用与氢氯噻嗪相当，具有一定的剂量依赖性。对尿液离子含量的测定发现，加味真武汤中、高剂量组和氢氯噻嗪可明显促进心衰大鼠尿液中Na+、K+的排泄作用(P<0.05)，与文献的研究一致[2]。本研究未见尿液Cl-的含量有明显改变。

影响尿液生成的因素较多，本试验以影响尿液生成的主要体液因子作为研究对象探讨加味真武汤利尿作用的机制。已知醛固酮(ALD)是一种类固醇激素，具有保钠排钾作用。抗利尿激素(ADH)由下丘脑分泌，主要作用是提高远曲小管和集合管对水的通透性，促进水的吸收，是尿液浓缩和稀释的关键性调节激素。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)具有强烈的缩血管作用，并通过增加醛固酮的分泌具有水钠潴留作用，在心衰发生过程中起重要作用。本研究发现加味真武汤各剂量组及氢氯噻嗪可不同程度减少AngⅡ、ALD及ADH的含量(P<0.05)。AngⅡ分泌的减少可抑制醛固酮的分泌，2者分泌量的减少均会促进钠和水的排泄，减少水钠潴留，减轻心衰大鼠的心脏负荷。AngⅡ分泌的减少会抑制ADH的分泌，从而降低远曲小管和集合管对水的通透性，使水的重吸收减少，尿液体积增加。故而解释了加味真武汤对心衰大鼠尿量增加及尿液中钠、钾排出的增加。本试验中加味真武汤对氯离子未见明显影响，其机制仍待进一步研究。

综上所述，加味真武汤各剂量组不同程度改善心衰大鼠的心功能，可能与其降低AngⅡ、ALD、ADH水平，促进Na+、K+排泄，从而促进尿液的排出有关。

[1] 张健，陈兰英.心力衰竭[M].人民卫生出版社，2011.

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(编校：王俨俨)

Protective effects of Jiawei Zhenwu decoction on rats with heart failure induced by adriamycin and its mechanism

YOU Guang-huiΔ

(Department of Pharmacy, Zhengzhou City People’s Hospital, Zhengzhou 450003, China)

ObjectiveTo explore the protective effects of Jiawei Zhenwu decoction on rats with heart failure induced by adriamycin and its mechanism.MethodsThe heart failure was established with adriamycin by tail intravenous injection. 3 mg/kg of adriamycin was injected on 1st, 3rdand 5thweek and 2 mg/kg of adriamycin was injected on 2nd, 4thand 6thweek, a total of 6 times. 60 rats were randomly divided into six groups, 10 rats in each group: blank control group, model group, low-, middle- and high-does Jiawei Zhenwu decoction(40,20,10 g/kg, intragastric administration), and hydrochlorothiazide group(positive drug group, 10.78 mg/kg, intragastric administration). The overt behavior was observed and 24 h urine volume, Na+, K+and Cl-content in urine, cardiac function and levels of angiotensin(AngⅡ), aldosterone(ALD) and antidiuretic hormone(ADH) in plasma were compared among each group.After the rat were sacrificed, the heart was taken out and stained by HE to analyse histopathologic examination. ResultsThe spontaneous activity and ingestion of rats improved after given Jiawei Zhenwu decoction. The 24h urine volume, Na+, K+content in urine increased of low-, middle- and high-does Jiawei Zhenwu decoction at different degrees(P<0.05), while there were no significant changes of Cl-contents; left ventricular end dilated pressure(LVEDP) decreased, left ventricular systolic pressure(LVSP), +dp/dtmaxand -dp/dtmaxincreased in low-, middle- and high-does Jiawei Zhenwu decoction at different degrees(P<0.05); the plasma levels of angiotensin(AngⅡ), aldosterone(ALD) and antidiuretic hormone(ADH) decreased(P<0.05).The pathological examination result showed that there was significant damage of myocardial cell and infiltration of monocyte and lymphocyte, myocardial cell of high-dose group almost returned to normal and middle-and low-dose group have improvement to some extent.ConclusionJiawei Zhenwu decoction could improve cardiac function, which may be related with the reduction of AngⅡ, ALD and ADH levels and promoting the excretion of Na+, K+so as to increase urine volume.

Jiawei Zhenwu decoction; heart failure; rats; protective effect

游广辉，通信作者，男，本科，主管药师，研究方向：药学，E-mail：313397265@qq.com。

R541.6+1

A

1005-1678(2015)11-0033-04